外周血微小RNA-216a與小兒病毒性心肌炎的相關性研究

施帥，趙佳，白曉鵬，李學奇，孫超宇

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：（1）年齡0～14 歲；（2）無先天性心臟病或心臟畸形。排除標準：（1）伴有嚴重臟器功能障礙者；（2）合并免疫系統(tǒng)疾病、代謝系統(tǒng)疾病者；（3）其他類型心肌炎者。

1.2 一般資料 選取2018年1月—2019年1月哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院收治的疑似病毒性心肌炎患兒38 例，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、心悸及氣促，確診為病毒性心肌炎患兒30 例（觀察組）；另選取同期體檢健康兒童30 例作為對照組。對照組中男18 例，女12 例；年齡0～14 歲，平均年齡（7.5±1.6）歲。觀察組中男19例，女11例；年齡0～14歲，平均年齡（7.8±1.2）歲。兩組兒童性別（χ2=2.757）、年齡（t=1.663）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有兒童監(jiān)護人對本研究知情并自愿簽署知情同意書。

1.3 病毒性心肌炎診斷標準［4］血清柯薩奇病毒（CVB）RNA 陽性并符合下列輔助檢查改變之一：（1）存在心功能不全的臨床癥狀；（2）超聲心動圖檢查結果示心臟擴大、室壁運動彌漫性降低；（3）心電圖檢查結果示以R 波為主的≥2 個主要導聯(lián)ST-T 段改變，竇房和房室傳導阻滯，完全性右/左束支阻滯，成聯(lián)律、多形、多源、成對或并行性期前收縮，非房室結及房室折返引起的異位性心動過速，低電壓（新生兒除外）及異常Q波。

1.4 檢測方法

1.4.1 血液標本分離 （1）全血標本分離：采集抗凝血液標本后2 h 內輕搖混勻，使用RNase-free 吸頭吸取1 ml 全血標本至1.5 ml 離心管中，置于-70 ℃冰箱中保存待測。（2）血清標本分離：采集非抗凝血液標本后室溫下靜置20 min，血液凝固后5 000 r/min 離心10 min（離心半徑5 cm），使用RNase-free 吸頭吸取1 ml 血清至離心管中，置于-70 ℃冰箱中保存待測。

1.4.2 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR） 采用RT-qPCR 檢測外周血miRNA-216a 表達量，具體步驟如下：（1）將RNA 樣本置于冰塊上溶解，放置5X RT Buffer 和雙蒸水（DDH2O）（滅DNA 及RNA 酶）于室溫溶解（35 ℃）；（2）配制miRNA 反轉錄體系于1.5 ml EP 管中，輕彈EP 管使反轉錄體系徹底混勻，3 000 r/min 離心30 s（離心半徑5 cm），收集管壁殘余試劑并置于冰塊上；（3）準備miRNA 反轉錄反應液，輕彈miRNA 反轉錄反應液使其充分混勻，3 000 r/min離心30 s（離心半徑5 cm），將反應液置于PCR 儀上，37 ℃下孵育60 min，85 ℃環(huán)境下5 min 激活反轉錄酶后反應終止，將反應產物cDNA 置于-20 ℃冰箱中保存待測，qPCR 前將cDNA 稀釋為1/5 倍濃度；（4）溶解2X All-in-One qPCR Mix 及50X ROX Reference Dye，3 000 r/min 離心30 s（離心半徑5 cm）后置于冰塊上；（5）采用DDH2O 稀釋Universal Adaptor PCR Primer 至濃度為2 μM；（6）于冰塊上準備PCR 反應液；（7）混勻并短暫離心PCR 反應體系，使所有反應液處于PCR 管底部，并置于PCR 儀上進行反應。

1.4.3 電化學發(fā)光法 采用電化學發(fā)光法檢測血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）水平，具體步驟如下：取10 μl 血清加入50 μl 生物素標記的抗肌鈣蛋白I（TnI）單克隆抗體和50 μl 三聯(lián)吡啶釕標記的抗TnI 單克隆抗體，37 ℃下孵育9 min 后加入20 μ1 鏈霉素標記包被的微粒子，37 ℃下孵育9 min 后經電化學發(fā)光分析儀自動檢測；血清cTnI 水平參考范圍為0～0.09 μg/L。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 采用ELISA 檢測血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，具體步驟如下：加入250 μ1 生物素標記的抗CK-MB 單克隆抗體，置于37 ℃水浴3 min，加入10 μl 待測血清混勻后置于37 ℃水浴10 min，加入50 μ1 三聯(lián)吡啶釕標記的抗CK-MB 單克隆抗體，5 min 內連續(xù)監(jiān)測吸光度變化，由生化分析儀微電腦計算并輸出CK-MB 值；血清CK-MB水平參考范圍為0～24 U/L。

1.5 觀察指標 比較兩組兒童外周血miRNA-216a表達量及血清cTnI、CK-MB 水平，記錄觀察組患兒住院時間及急性生理學及慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ（APACHE Ⅱ）評分。

手術并發(fā)癥情況:中毒性休克:觀察組無中毒性休克病例,對照組2例,切口感染:觀察組2例,對照組2例;觀察組中無腹腔感染患者,對照組4例,觀察組與對照組中均無腸梗阻患者,觀察組中無多器官功能衰竭患者。對照組中有1例多器官功能衰竭患者。對照組并發(fā)癥發(fā)生率為30%,觀察組并發(fā)癥發(fā)生率為6.67%。所有患者均經過6~12個月的隨訪,觀察組無復發(fā)病例。對照組中2例復發(fā)胃潰瘍,復發(fā)率為6.67%,組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（）表示，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料分析采用χ2檢驗；外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間、APACHE Ⅱ評分及血清cTnI、CK-MB 水平的相關性分析采用Pearson 相關分析；繪制受試者工作特征（ROC）曲線以評價外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平對小兒病毒性心肌炎的診斷價值，并計算曲線下面積（AUC），AUC 越大提示診斷價值越高。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB水平 觀察組患兒外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 相關性分析 觀察組患兒住院時間為（12.1±5.2）d，APACHE Ⅱ評分為（6.1±3.5）分。Pearson 相關分析結果顯示，外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間（r=0.409）、APACHE Ⅱ評分（r=0.607）及血清cTnI（r=0.491）、CK-MB（r=0.472）水平呈正相關（P＜0.05，見圖1）。

2.3 診斷價值 ROC 曲線顯示，外周血miRNA-216a表達量診斷小兒病毒性心肌炎的AUC 為0.662，血清cTnI 水平為0.705，血清CK-MB 水平為0.678，見表2、圖2。

表1 兩組兒童外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平比較（）Table 1 Comparison of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB between the two groups

表1 兩組兒童外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平比較（）Table 1 Comparison of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB between the two groups

注：miRNA-216a=微小RNA-216a，cTnI=心肌肌鈣蛋白I，CKMB=肌酸激酶同工酶

組別 例數(shù) miRNA-216a（×104 copies/ml）cTnI（μg/L）CK-MB（U/L）對照組 30 0.91±0.05 0.09±0.03 7±2觀察組 30 2.34±0.89 0.35±0.07 20±4 t 值 8.787 18.699 16.143 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平對小兒病毒性心肌炎的診斷價值Table 2 Diagnostic value of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB in diagnosing viral myocarditis in children

3 討論

圖1 外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間、APACHE Ⅱ評分及血清cTnI、CK-MB 水平相關性的散點圖Figure 1 Scatter plot for correlations of peripheral blood miRNA-216a expression quantity with hospital stays，APACHE Ⅱ score，serum levels of cTnI and CK-MB in children with viral myocarditis

圖3 外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平診斷小兒病毒性心肌炎的ROC 曲線Figure 3 ROC curve for diagnostic value of peripheral blood miRNA-216a expression quantity，serum levels of cTnI and CK-MB in diagnosing viral myocarditis in children

小兒病毒性心肌炎的具體發(fā)病機制尚未完全明確，主要涉及自由基調節(jié)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等［5］，且患兒病變病程、范圍及感染病毒類型不同則全身癥狀不同，多數(shù)患兒經積極治療可痊愈［6］。既往研究表明，病毒性心肌炎患兒病毒感染早期多無自覺癥狀，心電圖檢查顯示室性期前收縮、房性期前收縮、ST-T 段改變等，感染數(shù)周后心電圖檢查顯示正常或遺留心律失常［7］；輕癥自限型-病毒感染患兒感染1～3 周后出現(xiàn)心肌、輕微心前區(qū)不適癥狀，少數(shù)患兒出現(xiàn)心力衰竭和心臟擴大癥狀，治療后可逐漸恢復正常［8］；但部分急性重癥型-病毒感染患兒感染1～2 周后會出現(xiàn)心悸、胸痛、氣促等癥狀，并伴有奔馬律、心動過速、心力衰竭，嚴重者甚至出現(xiàn)心源性休克［6，9］。病毒性心肌炎患兒若得不到及時、有效治療則可能導致彌漫性心肌間質性炎性浸潤、心臟局造性炎性浸潤、心肌壞死、纖維蛋白溶解及心血管疾病等，且隨著患兒年齡增長，該疾病可成為患兒猝死的主要誘因之一［10］。因此，臨床應積極采取有效措施以減輕病毒性心肌炎患兒心肌損傷［5］。

miRNAs 為內源性非編碼RNA，可通過干擾信使RNA 而參與機體多種生理活動，并在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs 廣泛存在于血液和組織中，循環(huán)系統(tǒng)中miRNAs 包被于脂蛋白或脂質內，因此不易被RNA 酶分解，可作為疾病的生物學標志物［11］。WANG 等［12］研究表明，許多miRNAs 在腎癌組織中表達異常，因此臨床可通過調控靶基因表達而發(fā)揮抑癌基因或癌基因的生物學作用。SHU 等［13］研究結果顯示，miRNA-216a 具有胰腺特異性，其在胰腺中的表達是其他組織中最高表達水平的數(shù)百倍。此外，miRNA-216a 還具有介導藥物、表觀遺傳學干預等治療作用，進而對心臟和心血管具有保護作用［14］。

cTnI 是心肌細胞中的特有收縮蛋白，在鈣離子參與下可調控收縮蛋白的舒縮活動，但心肌細胞膜完整時其無法透過細胞膜而進入血液循環(huán)，心肌細胞損傷后細胞膜完整性受損，cTnI 可從心肌細胞內釋放并進入血液循環(huán)，導致血清cTnI 水平升高并維持5～10 d［15］。因此，血液cTnI 水平可作為心肌細胞損傷的特異性標志物，有助于評估病毒性心肌炎患兒病情嚴重程度。CK-MB 主要分布于心肌，是臨床常用的心肌損傷特異及敏感性標志物，心肌損傷后2～12 h 血清CK-MB 水平急劇升高并維持2～3 d［16］，但其恢復正常的時間較快，因此診斷窗口期較短、漏診率較高。本研究結果顯示，觀察組患兒外周血miRNA-216a 表達量及血清cTnI、CK-MB 水平高于對照組，提示病毒性心肌炎患兒存在心肌損傷；進一步行Pearson 相關分析結果顯示，外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒住院時間、APACHE Ⅱ評分及血清cTnI、CK-MB 水平呈正相關，提示外周血miRNA-216a 表達量與病毒性心肌炎患兒病情嚴重程度及心肌損傷程度有關。本研究結果還顯示，外周血miRNA-216a 表達量診斷小兒病毒性心肌炎的AUC 為0.662，血清cTnI 水平為0.705，血清CK-MB 水平為0.678，提示外周血miRNA-216a 表達量對小兒病毒性心肌炎的診斷價值與血清cTnI、CK-MB 水平相似。

綜上所述，外周血miRNA-216a 表達量與小兒病毒性心肌炎及其病情嚴重程度、心肌損傷程度有關，且其對小兒病毒性心肌炎的診斷價值與血清cTnI、CK-MB水平相似；但本研究為單中心研究，且樣本量較小，結果結論有待擴大樣本量、聯(lián)合多中心進一步證實。

作者貢獻：施帥進行文章的構思與設計，負責撰寫論文；孫超宇進行研究的實施與可行性分析，對文章整體負責，監(jiān)督管理；趙佳進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結果分析與解釋；白曉鵬進行論文的修訂；李學奇負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。