醬香型白酒中吡嗪類物質(zhì)體外抗炎作用研究

羅 強(qiáng)，劉 杰，劉志剛*

（深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518000）

白酒通常是由淀粉或其他含有糖質(zhì)的原料經(jīng)過多種工序而獲得的蒸餾酒[1]。白酒不僅供日常飲用，也是一種重要的藥材，有活血通脈、助藥力、增進(jìn)食欲等作用，如張仲景的《金匱要略》中記載的瓜蔞薤白白酒湯是中醫(yī)治療胸痹的著名方劑，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證實(shí)瓜蔞薤白白酒湯對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[2]、對冠心病的治療也有很好的效果[3]。醬香型白酒為中國白酒典型的白酒香型之一，其獨(dú)特的制酒工藝造就了獨(dú)特的風(fēng)味[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，醬香型白酒含有多種吡嗪類化合物，其含量高達(dá)63.6 mg/L[5]，遠(yuǎn)高于普通白酒。人類使用香料作為增味劑具有悠久的歷史，近年研究表明，吡嗪類化合物存在于多種香料中[6]；同時(shí)，研究顯示部分吡嗪類化合物具有一定的生物活性，如含吡嗪環(huán)的噻唑啉、噻唑烷酮具有優(yōu)秀的抗菌作用[7]、川芎嗪對紅藻氨酸誘導(dǎo)的大鼠海馬興奮性毒性具有保護(hù)作用[8]、可保護(hù)大鼠大腦免受缺血再灌注損傷[9]及改善體內(nèi)的肝臟炎癥[10]等。

在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中會(huì)伴隨著一系列的理化性質(zhì)的改變，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）等含量變化[11-12]，同時(shí)花生四烯酸代謝通路中前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）也在炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中的也起到很重要的作用[13]。有研究顯示，誘異型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）通?？捎杉?xì)胞因子和微生物內(nèi)毒素等炎性物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，從而產(chǎn)生持續(xù)高水平的NO[14]；同樣的，前列腺素E2（PGE2）是由花生四烯酸通過環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）產(chǎn)生[15]；細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）與PGE2均為引起炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子；而血紅素氧合酶（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)上調(diào)可抑制多種免疫效應(yīng)功能[16]。

醬香型白酒中含有多種吡嗪類物質(zhì)，其中三甲基吡嗪、四甲基吡嗪含量較高[17]，但由于乙醇、水及其他物質(zhì)的存在，其相關(guān)生物活性研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，并通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，進(jìn)而檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6、TNF-α的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達(dá)及對花生四烯酸代謝通路中與有關(guān)生成前列腺素E2（PGE2）關(guān)鍵酶的影響，研究吡嗪類化合物對炎癥模型中誘導(dǎo)型合酶iNOS及相關(guān)炎癥因子的變化等，探討其抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株：美國ATCC公司；醬香型白酒（53度）：貴州茅臺(tái)集團(tuán)；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphatesalinebuffer，PBS）：廣州瑞舒生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基：美國HyClone公司；0.25%胰蛋白酶：美國Gibco公司；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒：碧云天生物科技有限公司；SYBR@PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptase-polymerasechainreaction，RT-PCR）試劑盒：大連TaKaRa公司；活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）：佰易聚生物商城；2-甲基-3-丙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-丁基-3-甲基吡嗪、2-異丁基-3-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二吡嗪、2-丙基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-異丙基吡嗪：阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IC型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；INCO2108 型CO2培養(yǎng)箱：德國Memmert公司；TECAN infiniteM200多功能酶標(biāo)儀：美國ThermoFisherScientific公司；2K15型低溫高速離心機(jī)：美國Sigma公司；R2487高效液相色譜（highperformance liquidchromatography，HPLC）：美國Waters公司；Agilent 1200液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）：美國Agilent公司；Epics Altra型流式細(xì)胞儀：美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 醬香型白酒中非乙醇類物質(zhì)的提取及吡嗪類溶液的配制

250 mL分液漏斗中加入50 mL白酒、20 mL水和90 mL氯仿，振蕩搖勻、靜置，分離氯仿層，重復(fù)3次，合并氯仿層。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（4℃）除去氯仿獲得有機(jī)層化合物。真空凍干水層得水層化合物，合并有機(jī)層及水層化合物為酒中非乙醇類物質(zhì)（Jiu non-ethanol，JNE），-20℃避光保存。參照文獻(xiàn)方法，利用液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法檢測酒中非乙醇類物質(zhì)（JNE）[18]，用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）檢測酒中吡嗪類化合物的含量[19]。吡嗪類化合物及酒中非乙醇類物質(zhì)（JNE）溶于PBS，初始質(zhì)量濃度為10 mg/mL，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5%CO2、90%相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)[20]。將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，并按100 μL/孔接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入0.01 mg的吡嗪類化合物及酒中非乙醇類物質(zhì)（JNE），終質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL，將處理好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入0.1 μg的LPS，終質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，CCK-8檢測細(xì)胞活力。

將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，并按100 μL/孔接種于96孔板中，將實(shí)驗(yàn)分為6組：①正常組：正常培養(yǎng)，未對細(xì)胞做任何處理；②LPS組：細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，加入0.4 μg/孔，終質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的LPS培養(yǎng)6 h；③酒精+LPS組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.024 mg乙醇∶水（53∶47，V/V），終質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入0.4 μg/孔，終質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的LPS培養(yǎng)6 h；④白酒+LPS組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.024 mg白酒，終質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入0.4 μg/孔，終質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的LPS培養(yǎng)6 h；⑤JNE+LPS組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.024 mg酒中非乙醇類物質(zhì)（JNE），終質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入0.4 μg/孔，終質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的LPS培養(yǎng)6 h；⑥吡嗪化合物-5（Biqin-5，BQ-5）+LPS組：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.024 mg BQ-5，終質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入0.4μg/孔，終質(zhì)量濃度為2.0mg/L的LPS培養(yǎng)6 h。CCK-8檢測化合物對細(xì)胞活力的影響及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的情況[21]。采用ELISA試劑盒測定NO、IL-1、IL-6、TNF-α等相關(guān)炎癥因子及PGE2濃度[22]。細(xì)胞裂解后收集裂解物，提取RNA，采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測定iNOS、COX-2、HO-1、IL-1、IL-6、TNF-α等基因表達(dá)的量。

1.3.3 RNA提取及cDNA的合成

將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，并按2 mL/孔接種于6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入0.48 mg的白酒、BQ-5、JNE和乙醇∶水（53∶47，V/V），終質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL，將處理好的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后每孔加入4 μg的LPS，終質(zhì)量濃度為2.0 mg/L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，取出6孔板，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，并加入0.50 mL Biozol Reagent裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液于2.0 mL離心管，室溫靜置2 min后加入0.10 mL氯仿，劇烈振蕩15 s混勻，靜置3 min。在4 ℃、12 000×g條件下離心4 min，取上層水相加入等量異丙醇，漩渦振蕩，室溫放置10 min；12 000×g條件下離心10min，棄上清，沉淀中加入1.0mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇洗滌，室溫干燥后加入30 μL的焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶解即得總RNA，其OD260nm/280nm值為1.8～2.0?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸（complementarydeoxyribonucleic acid，cDNA）的合成按SYBR@PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒操作說明進(jìn)行，產(chǎn)物保存于-20℃，備測。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

iNOS、COX-2、HO-1、IL-1、IL-6、TNF-α和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）cDNA參照GenBank中公布的序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由吉賽生物技術(shù)有限公司（廣州）合成。PCR擴(kuò)增具體實(shí)驗(yàn)采用總反應(yīng)體積10.0 μL體系：SYBR-Premix ExTaqTMⅡ 5 μL，10 μmol/L由吉賽生物技術(shù)有限公司合成的上述7種蛋白的cDNA引物2.0 μL，cDNA模版1.0 μL，雙蒸水2.0 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 s，變性95℃5 s，熒光檢測72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對陰性對照和陽性對照采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對BQ-5處理效應(yīng)進(jìn)行回歸分析。P＜0.05表明具有顯著差異，P＜0.01表明具有極顯著差異，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡嗪類化合物對RAW264.7細(xì)胞的毒作用

對不同的吡嗪類化合物單體以一定濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，用CCK-8檢測細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，吡嗪類化合物質(zhì)量濃度低于0.35mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖能力與對照組相比，差異均無顯著性（P＞0.05），表明吡嗪類化合物的濃度在一定范圍內(nèi)對細(xì)胞無明顯毒性（以下研究吡嗪類化合物質(zhì)量濃度均＜0.35 mg/mL）。此外，0.10 mg/mL的吡嗪類化合物與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，加入0.1 μg/孔，終質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的LPS培養(yǎng)4 h，CCK8檢測細(xì)胞增殖，用正常細(xì)胞不做任何處理作為空白對照，LPS作為陽性對照。結(jié)果見表1。

表1 吡嗪類化合物對RAW264.7細(xì)胞增殖能力影響Table 1 Effect of pyrazines on proliferation of RAW264.7 cells

由表1可知，相比于對照（Control）組，LPS組細(xì)胞增殖顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率為18.9%，上升18.9%。而相比于LPS組，與BQ-5、BQ-9、BQ-10共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。其他吡嗪類化合物則對細(xì)胞凋亡率未有明顯影響（P＞0.05）。其中，BQ-5處理的細(xì)胞凋亡率為（8.5±7.26）%，相比于其他組，對增強(qiáng)細(xì)胞抗LPS刺激產(chǎn)生損傷的能力最強(qiáng)。不同于BQ-5組，白酒及乙醇組細(xì)胞存活率均低于LPS處理組，推測可能是由于乙醇降低了細(xì)胞抗LPS刺激產(chǎn)生損傷的能力。因此，選擇BQ-5進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.2 BQ-5對RAW264.7細(xì)胞凋亡及NO，PGE2，TNF-α等相關(guān)炎癥因子的影響

為了便于比較，將正常組的NO、TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2濃度設(shè)為1，其他組濃度為相對值，BQ-5對PGE2、NO及TNF-α等相關(guān)炎癥因子的影響結(jié)果見表2，其抗LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞凋亡作用，結(jié)果見圖1。由表2可知，LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞使NO、IL-6、IL-1、TNF-α及PGE2分泌顯著升高（P＜0.05）。而BQ-5組與LPS組相比，TNF-α、NO、PGE2及IL-1的含量均顯著降低（P＜0.05），IL-6含量無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)合圖1結(jié)果可以說明，BQ-5能有效的降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，同時(shí)提高細(xì)胞抗LPS損傷的能力。不同于BQ-5組，白酒及乙醇組中TNF-α、NO、IL-1及IL-6的含量均高于LPS組。推測可能是乙醇對細(xì)胞的損傷作用導(dǎo)致的。有趣的是JNE中TNF-α、NO、IL-1及IL-6的含量均低于LPS組，其原因可能是白酒中的其他物質(zhì)增強(qiáng)了細(xì)胞的抗LPS損傷的能力。

圖1 BQ-5抗LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡作用Fig.1 Antagonistic effect of BQ-5 on LPS-induced RAW264.7 cells apoptosis

表2 BQ-5對PGE2、NO及TNF-α等相關(guān)炎癥因子的影響Table 2 Effect of BQ-5 on PGE2,NO,TNF-α and other related inflammatory factors

2.3 BQ-5對LPS誘導(dǎo)的PLA2、COX-2活性的影響

BQ-5對LPS誘導(dǎo)的PLA2、COX-2活性的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，LPS誘導(dǎo)后，PLA2、COX-2的活性顯著增加（P＜0.05），而JNE和BQ-5對PLA2、COX-2的活性具有不同程度的抑制作用（P＜0.05），但白酒及乙醇組中PLA2、COX-2的活性反而顯著增加（P＜0.05），推測是乙醇對細(xì)胞的損傷協(xié)同LPS誘導(dǎo)PLA2、COX-2的活性上升的。

圖2 BQ-5對LPS誘導(dǎo)的PLA2、COX-2活性的影響Fig.2 Effect of BQ-5 on LPS-induced PLA2 and COX-2 activities

2.4 BQ-5對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性介質(zhì)（IL-1、IL-6、TNF-α）

及誘導(dǎo)型合酶（iNOS、COX-2、HO-1）基因表達(dá)的影響

BQ-5對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性介質(zhì)及誘導(dǎo)型合酶基因表達(dá)的影響結(jié)果見圖3。同樣的，為了便于比較，將正常組的iNOS、COX-2、HO-1、IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量設(shè)為1，其他組表達(dá)量為相對值。由圖3可知，相比于正常組，LPS誘導(dǎo)后誘導(dǎo)型合酶iNOS、COX-2、HO-1 mRNA的表達(dá)分別是正常組的56.2倍（P＜0.01）、13.7倍（P＜0.01）及3.97倍（P＜0.05）。相比于LPS組，BQ-5組的誘導(dǎo)型合酶iNOS、COX-2 mRNA的表達(dá)分別下降40.1%（P＜0.05）、59.7%（P＜0.05），HO-1沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 BQ-5對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性介質(zhì)（A）及誘導(dǎo)型合酶（B）基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of BQ-5 on LPS-induced cellular inflammatory mediators(A)and inducible synthase(B)gene expression

相比于正常組，LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞炎性介質(zhì)（IL-1、IL-6、TNF-α）的mRNA表達(dá)增加分別是正常組的78.7倍（P＜0.01）、35.3倍（P＜0.01）及5.63倍（P＜0.05）。相比于LPS組，BQ-5組的IL-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)分別下降59.6%（P＜0.05）、69.4%（P＜0.05）、67.5%（P＜0.05）。

不同于BQ-5可降低細(xì)胞炎性介質(zhì)及誘導(dǎo)型合酶mRNA的表達(dá)，白酒及乙醇未表現(xiàn)出類似的作用。JNE對細(xì)胞炎性介質(zhì)及誘導(dǎo)型合酶mRNA的表達(dá)的影響與BQ-5類似，推測是白酒中的非乙醇類物質(zhì)發(fā)揮的作用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)針對醬香型白酒中吡嗪類化合物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷及對相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。首先用CCK-8檢測白酒中含有的各種吡嗪類化合物細(xì)胞活性的影響，其中醬香型白酒中吡嗪類化合物（BQ-5）處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率為（8.5±7.26）%，相比于其他化合物，對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)性更強(qiáng)。然后將實(shí)驗(yàn)分為6組，用流式細(xì)胞術(shù)檢測6組細(xì)胞的凋亡情況，其中BQ-5處理的細(xì)胞存活率為（8.6±2.28）%，是6組中除空白組外最高，進(jìn)一步說明BQ-5對細(xì)胞保護(hù)作用。提取上述各組細(xì)胞的mRNA和炎癥因子，檢測其中NO、TNF-α及IL-1的生成與釋放，相比于LPS組，iNOS、TNF-α及IL-1的基因表達(dá)分別下降23倍、4.6倍、46.6倍；相比于LPS組，NO、TNF-α及IL-1的釋放量分別下降0.98倍、0.41倍、4.73倍，說明BQ-5能顯著降低NO、TNF-α及IL-l的生成與釋放（P＜0.05）。同時(shí)檢測COX-2、PLA2的活性變化、COX-2的基因表達(dá)情況和PGE2的釋放情況，BQ-5處理組的COX-2、PLA2的相對活性與LPS組相比，分別降低44%和71%，COX-2的基因表達(dá)量降低8.18倍，PGE2的釋放量降低42%，結(jié)果表明，BQ-5可通過抑制PLA2活性和COX-2表達(dá)而減少PGE2合成，這可能是BQ-5抗炎的另一主要作用機(jī)制。由此可以推測BQ-5可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO及TNF-α等炎癥因子來發(fā)揮作用的。

本研究顯示醬香型白酒中的非乙醇成分及吡嗪類化合物（BQ-5）具有直接的抗LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥作用，說明醬香型白酒中的吡嗪類物質(zhì)具有增強(qiáng)細(xì)胞抗炎性損傷的能力。其發(fā)揮抗炎作用與減少RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)生成與釋放、抑制花生四烯酸代謝途徑PGE2的合成的關(guān)鍵酶活性密切相關(guān)。同時(shí)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒及酒精組未顯示出任何增強(qiáng)細(xì)胞抗炎能力，推測其中的乙醇降低了細(xì)胞的抗炎能力。