土壤來源抗MRSA放線菌的篩選及次級(jí)代謝潛力評(píng)估

梁大敏，田 鵬，劉 鐵，吳德靜，岳昌武，3*

（1.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563003；

2.遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室遵義市基因遺傳病精準(zhǔn)診斷及藥物靶向治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003；

3.延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000）

多藥耐藥病原菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）、耐青霉素肺炎鏈球菌（penicillin-resistantStreptococcus pneumoniae，PRSP）、耐多藥結(jié)核分枝桿菌（multiple drugs resistant tuberculosis，MDR-TB）等革蘭氏陽性菌和耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）腸桿菌等革蘭氏陰性菌[1-2]，其介導(dǎo)的感染性疾病是當(dāng)今世界需要亟待解決的健康安全問題。現(xiàn)有的抗生素對(duì)MRSA介導(dǎo)的感染性疾病治療效果降低或者無效，導(dǎo)致患者死亡率增加，已超過艾滋病和肺結(jié)核患者[3-4]，美國(guó)每年大約有23 000名患者死于MRSA引起的感染[5-6]。因此，針對(duì)MRSA開發(fā)新的抗生素顯得極其重要。

放線菌（actinomycete）是一種能產(chǎn)大量活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的絲狀細(xì)菌，臨床上2/3的抗生素主要來源于放線菌。已有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，放線菌代謝產(chǎn)物中具有生物活性的物質(zhì)約12000種，其中具有抗生素活性的代謝產(chǎn)物多達(dá)10000種，是新型抗生素開發(fā)的寶貴資源庫。目前，基因篩選的方法已被較多應(yīng)用于放線菌新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究，且基本都是基于聚酮合酶I型（polyketide synthase I，PKS I）、聚酮合酶II型（polyketide synthase II，PKS II）、非核糖體多肽合成酶（nonribosomalpeptidesynthetase，NRPS）和后修飾酶[如鹵化酶（halogenase，Hal）]進(jìn)行的基因篩選[8-9]。LI X G等[10]使用還原黃素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavine adenine dinucleotide，F(xiàn)ADH2）依賴型鹵化酶基因篩選的方法，從163株紅樹林放線菌中篩選出26株具有抑菌或抑制腫瘤活性的陽性菌株，證明了鹵化酶基因篩選的有效性；LU Y等[11-12]從貴州梵凈山等地篩選出Hal、NRPS、PKS I陽性鏈霉菌（Streptomycessp.）FJS31-2，且從中分離出具有抗MRSA、抗肝癌的新化合物zunyimycin A、B、C；楊小燕等[13]利用靶向PKS II的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)從167株海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)12株P(guān)KS II陽性菌株，且從陽性菌株Streptomycessp.PKU-MA00218中發(fā)現(xiàn)新的聚酮類天然產(chǎn)物angucyclinone C。

貴州省黔北地區(qū)保留了其獨(dú)特的原生態(tài)環(huán)境，這些原生態(tài)環(huán)境中可能蘊(yùn)藏極為豐富而獨(dú)特的微生物資源，具有從中開發(fā)微生物抗菌藥物的巨大潛力，值得進(jìn)一步研究[9]。因此，本研究以抗MRSA活性為導(dǎo)向，同時(shí)基于NRPS、PKSI、PKS II 3種產(chǎn)物骨架合成基因和Hal修飾關(guān)鍵酶基因勘探，對(duì)來自黔北地區(qū)土壤放線菌進(jìn)行分離篩選，以期找到具有較好抗MRSA活性的放線菌菌株，為獲得可能創(chuàng)制抗MRSA新藥的苗頭藥或先導(dǎo)化合物提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土樣：32份試驗(yàn)土樣采集于貴州遵義鳳凰山公園（10份）、赤水丹霞山（12份）、大板水國(guó)家森林公園（10份）周邊人員活動(dòng)較少地區(qū)、海拔500～1 000 m左右的除地表腐殖質(zhì)10～20cm的土層，分裝于無菌樣品采集袋中常溫保存運(yùn)輸。

1.1.2 菌株

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）31：由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基

改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，NaCl0.5g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，玉米汁50 mL，土壤浸出物[14]50 mL，土壤樣品細(xì)粉10 g，復(fù)合維生素浸提物10 mL，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2，115℃高壓滅菌30 min。其中玉米汁的制備：稱取新鮮的玉米100 g，加入1 L蒸餾水，用豆?jié){機(jī)攪拌均勻后，濾掉廢渣，補(bǔ)加蒸餾水至2 L，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；?fù)合維生素浸提物的制備：取21金維他多維元素片20片（0.825 g/片）研磨成粉，入15 mL無水乙醇和35 mL無菌水振蕩懸浮，8 000 r/min離心10 min，上清用微孔濾膜過濾除菌后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

土壤浸汁腐殖酸培養(yǎng)基[14]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，微量元素預(yù)混液（ZnSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2 g/L，MnCl2·4H2O 2g/L，CuSO4·5H2O 2 g/L，Na2B4O7·10H2O 2 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 2 g/L）0.5 mL，腐殖酸2.0 g，瓊脂18 g，土壤浸出物1 L，pH 7.2，121℃高壓滅菌30 min。

國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃（internationalStreptomycesproject，ISP）2培養(yǎng)基[15]：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌30 min。

改良的葡萄糖酵母麥芽（glucose yeast malt，GYM）鏈霉素培養(yǎng)基[16]：葡萄糖4 g，CaCO32 g，麥芽抽提物10 g，酵母抽提物4g，微量元素預(yù)混液0.5mL，腐殖酸浸出液10mL，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌30 min。

GYM液體培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，蒸餾水定容至1 L，115℃高壓滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基[16]：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g。

1.1.4 主要試劑

抗生素、抗菌藥物儲(chǔ)存液（重鉻酸鉀50 mg/L，制霉菌素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放線菌酮50 mg/L）：德國(guó)Sigma公司；酚、氯仿等脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；ExTaq酶（5U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mixture、TaqBuffer等分子生物學(xué)試劑及酶類：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSP-400培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；E002092超級(jí)潔凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；Direct-Q5UV超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司；MLS-3781L-PC自動(dòng)蒸汽滅菌器：日本松下公司；T100快速梯度PCR儀：美國(guó)伯樂公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)伯樂公司；DYCP-33A電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

土壤樣品預(yù)處理：每份樣品分別稱2 g于無菌研缽中，加入0.2 g CaCO3，用無菌杵研磨成細(xì)粉，裝入50 mL無菌離心管中，28℃風(fēng)干2周后，加入30 mL無菌水，置于28℃搖床上150 r/min振蕩1 h使土壤充分懸浮，55℃處理20 min，促使放線菌孢子萌發(fā)[14]。

菌株的分離純化：采用梯度稀釋法將土壤預(yù)混液分別稀釋成10-2、10-3和10-43個(gè)濃度梯度，振蕩混勻，分別吸取不同濃度梯度的土樣懸濁液200 μL均勻涂布于4種放線菌分離培養(yǎng)基（改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基、土壤浸汁腐殖酸培養(yǎng)基、ISP2培養(yǎng)基、改良的GYM鏈霉素培養(yǎng)基）上，28℃靜置培養(yǎng)，隨時(shí)觀察培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取目的菌株進(jìn)行分離純化并保藏。

1.3.2 抗MRSA活性的測(cè)定

將MRSA接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)6～8 h，取10 mL菌液與200 mL未凝固的LB培養(yǎng)基混合均勻后倒板。用無菌打孔器挖取直徑6 mm的分離菌株于含有MRSA的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈的有無。

1.3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[17]提取活性菌株的基因組總DNA，以其為模板，利用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：EXTaq酶0.25μL，10×buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）4 μL，MgCl24μL，模板DNA2μL，27F1μL，1492R1μL，雙蒸水（ddH2O）32.75μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30s，72℃延伸90s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海英駿生物公司完成。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用Mega 6.0軟件中的鄰接（neighbour joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[18-19]。

1.3.4 功能基因的勘探

以提取的基因組DNA為模板，利用Hal、PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS基因的保守引物（見表1）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)不同的引物和擴(kuò)增片段選擇相應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系[13，20-22]，PCR擴(kuò)增條件[22]：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30 s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 本研究所采用的引物、序列及用途Table 1 Primers and its sequences and application used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化及抗MRSA分析

從采集的32份土樣中共分離到169株放線菌菌株，其中赤水丹霞山土樣65株（以CS命名菌株）、鳳凰山公園土樣45株（以FHS命名菌株）、大板水國(guó)家森林公園土樣59株（以DBS命名菌株）。采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌株的抗MRSA活性進(jìn)行測(cè)定，部分分離菌株的抗MRSA活性結(jié)果見圖1。

圖1 部分分離菌株抗MRSA活性測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of anti-MRSA activity of partiallyisolated strains

由圖1可知，不同分離菌株具有不同程度的抗MRSA活性，且分離的169株菌株中有68株具有抗MRSA活性，占總分離菌株的40.24%。因此，以68株活性抗MRSA菌株進(jìn)行后續(xù)的基因組勘探。

2.2 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

選取68株活性菌株，利用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，部分結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度約1 500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

圖2 活性菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA PCR amplification products of active strains

將68株活性菌株的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行Blast同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega 6.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株FHS2-3為諾卡氏菌屬（Nocardiasp.），其他分離菌主要為鏈霉菌屬（Streptomycessp.），這與程少軍等[23]的研究結(jié)果一致，說明在貴州喀斯特土壤環(huán)境中鏈霉菌屬在放線菌中是優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖3 基于16S rRNA序列68株活性菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 68 active strains based on 16S rRNA sequences

同時(shí)Blast比對(duì)中，菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中已有菌株的16SrRNA序列相似性＜98%，說明本地區(qū)土壤放線菌中可能蘊(yùn)藏潛在的較新穎菌株，具有開發(fā)的潛力。

2.3 次級(jí)代謝潛力基因勘探

CHRISTIANSEN G等[24]指出鹵化酶基因、聚酮合酶基因、非核糖體肽基因等可以作為指示基因?qū)ξ⑸锂a(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力進(jìn)行快速評(píng)估。利用微生物的基因組信息預(yù)測(cè)其合成特定天然產(chǎn)物的潛能，進(jìn)而進(jìn)行新化合物分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定的基因組挖掘技術(shù)。

因此，本研究對(duì)具有抗MRSA活性的68株活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成過程中的修飾酶基因鹵化酶（Hal）及催化主骨架合成的非核糖體肽合成酶（NRPS）、I型聚酮合酶（PKS I）、II型聚酮合酶（PKS II）基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表2。由表2可知，68株活性菌株中，Hal基因陽性的菌株12株，占活性菌株的17.65%，PKS I基因陽性菌株18株，占活性菌株的36.47%，PKS II基因陽性的菌株42株，占活性菌株的61.77%，NRPS基因陽性的菌株22株，占活性菌株的32.35%。說明黔北地區(qū)放線菌基因組中存在多種化合物骨架合成酶及后修飾酶相關(guān)基因，提示可能含有骨架多樣結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，應(yīng)進(jìn)一步深入挖掘。

表2 68株活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因勘探Table 2 Secondary metabolic product gene exploration of 68 active strains

續(xù)表

注：“+”表示結(jié)果呈陽性，具有該基因；“-”表示結(jié)果呈陰性，無該基因。

3 結(jié)論

本研究從32份土樣中共分離純化到169株放線菌，其中68株菌株具有抗MRSA活性，占總分離菌株的40.24%。通過16S rRNA序列分析可知，68株活性菌株主要為鏈霉菌屬（Streptomycessp.），其中菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7與NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中已有菌株的16S rRNA序列相似性＜98%，說明本地區(qū)土壤放線菌中可能蘊(yùn)藏潛在的較新穎菌株，具有開發(fā)的潛力。

通過對(duì)68株活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因的勘探可知，Hal陽性菌株占17.65%，PKSI陽性菌株占36.47%，PKSII陽性菌株占61.77%，NRPS陽性菌株占32.35%，其中菌株DBS9-1、DBS12-6、DBS8-13、DBS22-6、CSDG1-2、FHS5-10、FHS10-22中同時(shí)含有NRPS或Hal、PKSI、PKSII三種基因，本實(shí)驗(yàn)可為后續(xù)通過激活特定合成的基因組定向挖掘該類化合物等研究提供參考。