分離自傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品中降膽固醇乳酸菌的篩選與評(píng)價(jià)

李 堯 張羽竹 張 利 楊靖鵬 王 菁 樊明濤 魏新元

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

維持體內(nèi)膽固醇平衡對(duì)于身體健康至關(guān)重要， 體內(nèi)膽固醇的平衡源于機(jī)體有序而復(fù)雜的合成、代謝、吸收和消除[1-2]。 人類的高膽固醇血癥已被證明是引起動(dòng)脈粥樣硬化， 導(dǎo)致心腦血管疾病的主要原因[3]。 高膽固醇與許多代謝綜合癥相關(guān)，包括肥胖、高血脂、高血糖和高血壓等。 為了保證健康，目前，對(duì)降低血糖、血清膽固醇和甘油三酯水平的研究頗多[4-5]，藥物防治和控制飲食是最主要的兩種途徑。 然而，使用藥物治療費(fèi)用大，受到個(gè)人經(jīng)濟(jì)制約，而且藥物存在副作用[6]?？刂骑嬍常椭?、 低膽固醇及低糖食品可以達(dá)到一定的降低效果，然而此類食品相對(duì)很少，也存在價(jià)格偏高的問題，難以長期維持，而且其功效性也會(huì)隨著時(shí)間逐漸降低[7]。 新的飲食方法便漸漸產(chǎn)生，包括在食品中添加或增加可溶性纖維[8]、大豆蛋白[9]、植物固醇類[10]、益生菌和益生元[11]等。

益生菌是對(duì)宿主有益的一定數(shù)量的微生物[12-13]。近年來益生菌的研究和應(yīng)用越來越多[14-16]。乳酸菌（lactic acid bacteria）普遍被認(rèn)為是安全的益生菌，人體和動(dòng)物體的腸道內(nèi)大量存在。研究表明足夠數(shù)量的乳酸菌具有降低血清膽固醇水平的效果，既能平衡體內(nèi)合成的膽固醇量，也能降低食源性膽固醇量[17]。 將具有降膽固醇性能的乳酸菌應(yīng)用于飲食是一種不錯(cuò)的選擇， 乳酸菌不僅能起到降低膽固醇的功效， 而且還有維持腸道微生態(tài)平衡的作用[18]。 影響乳酸菌降膽固醇的因素很多，包括溫度，菌株數(shù)量和種類，pH，時(shí)間，益生元等[19-20]。目前， 關(guān)于益生菌降膽固醇的機(jī)制主要通過益生菌細(xì)胞同化作用，細(xì)胞壁的吸附，共沉淀，共沉淀與同化的結(jié)合作用[21-22]，并最終隨著益生菌排出體外，從而降低腸道環(huán)境中膽固醇存在量，減少人和動(dòng)物對(duì)飲食攝入的膽固醇的吸收[14]。

本研究采用操作相對(duì)簡單的硫酸鐵銨測定膽固醇含量法。 從本實(shí)驗(yàn)室分離自傳統(tǒng)食品的大量乳酸菌菌株中篩選降膽固醇效果較好者， 然后利用更精確的測定膽固醇含量的鄰苯二甲醛法，確定乳酸菌菌株的降解膽固醇活性， 分析這些優(yōu)良菌株的耐膽鹽特性、生長特性、產(chǎn)酸特性，研究了降膽固醇的能力與不同生長時(shí)期的關(guān)系， 評(píng)估這些菌株的耐酸特性及在模擬胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 融合魏斯氏菌（Weissella confusa），4 株，分別編號(hào)WS1～WS4；短乳桿菌（Lactobacillus brevis），4 株，分別編號(hào)LB1～LB4；食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），5 株，分別編號(hào)CW1～CW5；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），17 株，分別編號(hào)LP1～LP17，共30 株乳酸菌菌株，均分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS （Man Rogosa and Sharp Medium， MRS）培養(yǎng)基（1 000 mL）：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母浸粉4 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，自然pH，121 ℃高壓滅菌15 min。

改良MRS：MRS 培養(yǎng)基中加入1%的碳酸鈣，混勻。

MRS-CHOL（膽固醇MRS 培養(yǎng)基）：MRS 培養(yǎng)基中， 含0.2%巰基乙酸鈉，0.2%膽鹽，100 μg/mL的膽固醇。

1.1.3 主要試劑 膽固醇（≥95%），分析純，購自Sigma-Aldrich；鄰苯二甲醛，分析純，購自Solarbio；胃蛋白酶，優(yōu)級(jí)純，購自Solarbio。

膽固醇儲(chǔ)存液，50 mg 膽固醇溶于無水乙醇中，定容至50 mL，質(zhì)量濃度1 mg/mL。

硫酸鐵銨顯色劑： 溶解4.463 g 硫酸鐵銨于100 mL 85%的磷酸中，即為儲(chǔ)備液。 吸取該儲(chǔ)備液10 mL，用濃硫酸定容至100 mL，即為顯色劑[23]。

鄰苯二甲醛顯色劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）：50 mg 鄰苯二甲醛溶于100 mL 冰乙酸即可[12]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌活化、 復(fù)壯與馴化 取冷凍保藏的乳酸菌菌種菌液100 μL 加入5 mL MRS 培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)取培養(yǎng)液在改良MRS 平板上進(jìn)行劃線分離，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，從平板上挑取菌落大，溶鈣圈明顯的單菌落繼續(xù)在改良MRS 平板上劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h，按照此方法連續(xù)劃線分離3 次， 最終獲得的溶鈣圈明顯的大單菌落轉(zhuǎn)接到斜面上培養(yǎng)后保藏備用[24]。

按照上述活化復(fù)壯的方法將菌株接種于含有0.1%膽鹽的MRS 培養(yǎng)基進(jìn)行馴化并轉(zhuǎn)接到斜面上培養(yǎng)后保藏備用。

1.2.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1 硫酸鐵銨法 取質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的膽固醇儲(chǔ)存液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 分別加入10 mL 干凈試管中， 依次加入無水乙醇1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5 mL，最后依次緩慢加入2 mL 配好的硫酸鐵銨試劑， 混勻， 待管冷卻至室溫后，560 nm 波長下比色[24]。 以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 鄰苯二甲醛法 取質(zhì)量濃度為1 mg/mL的膽固醇儲(chǔ)存液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 分別于10 mL 干凈試管中，60 ℃水浴， 待乙醇揮發(fā)干凈，加2 mL 現(xiàn)配的鄰苯二甲醛顯色劑，振蕩均勻后，室溫靜置10 min，將1 mL 濃硫酸緩慢加入，混勻，靜置20 min，560 nm 波長下比色[12]。 以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 降膽固醇乳酸菌的初篩 根據(jù)對(duì)硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法的比較， 在分析本實(shí)驗(yàn)室分離的30 株乳酸菌的降膽固醇能力，初步篩選優(yōu)良的降膽固醇乳酸菌菌株試驗(yàn)中， 本研究選擇采用操作較為簡單快捷的硫酸鐵銨法測定膽固醇含量。

將活化的對(duì)數(shù)生長后期的乳酸菌等量分別接種等體積的含膽固醇的MRS 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)到穩(wěn)定期，培養(yǎng)液濁度大致相同。將乳酸菌培養(yǎng)液離心（5 000 g，10 min）的上清液2 mL 至干凈試管中，加無水乙醇至10 mL，充分搖勻，4 500 g離心10 min， 取上清液1 mL 至新的干凈試管，再加入2 mL 硫酸鐵銨顯色液，充分混合，待冷卻后于560 nm 處測定吸光值[24-25]。 以未接種乳酸菌的膽固醇MRS 培養(yǎng)基為對(duì)照測定其中的膽固醇總量。上清中檢測出來的膽固醇含量越低，說明膽固醇降低效率越大，乳酸菌降膽固醇的能力越強(qiáng)。

膽固醇降低率=A-B/A×100%

其中：A——未接種乳酸菌的膽固醇MRS 培養(yǎng)基中膽固醇含量；B——試驗(yàn)菌株發(fā)酵后上清液中膽固醇含量。

1.2.4 膽鹽耐受性能分析 通過分析乳酸菌在含膽鹽的培養(yǎng)基中的生長情況來判斷其膽鹽耐受性能。在液體MRS 培養(yǎng)基中加入0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（W/V）的膽鹽，以不含膽鹽的MRS 培養(yǎng)基作為對(duì)照[26-27]?；罨瘮U(kuò)大培養(yǎng)后的優(yōu)選乳酸菌菌株按2%（V/V）的接種量加入到含不同膽鹽濃度的MRS 培養(yǎng)基中， 每個(gè)試驗(yàn)3 次重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h 后搖勻， 測定不同菌株在不同濃度膽鹽里生長的渾濁度（吸光度OD600）來分析其耐受水平。

膽鹽耐受力（%）=含膽鹽的培養(yǎng)基的OD 值/空白培養(yǎng)基的OD 值×100%

1.2.5 初篩降膽固醇能力較強(qiáng)菌株的降膽固醇效力分析 膽固醇降低效力表示單位菌體量對(duì)膽固醇的降低量。 乳酸菌降膽固醇效力的分析采用鄰苯二甲醛法Ying Huang1[28]。將優(yōu)選菌株活化擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照2%（V/V）的接種量分別接種于等體積的含或者不含0.2%膽鹽的MRS-CHOL 培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)20 h，測定培養(yǎng)物在600 nm 的吸光度值，并以此樣品5 000 g，離心10 min 收集上清液； 接著取1 mL 上清液加入干潔的試管中，再加入2 mL 33%的KOH，3 mL 的無水乙醇，充分搖勻后37 ℃水浴加熱15 min 后，冷卻至25 ℃；再向管中加5 mL 正己烷，1 mL 無菌水， 漩渦振蕩2 min，待相分離后，取3 mL 正己烷層（上層）放入干凈玻璃試管，氮吹儀干燥后，向試管加入4 mL 的鄰苯二甲醛顯色液 （現(xiàn)配現(xiàn)用）， 室溫靜置10 min， 緩慢注入濃硫酸2 mL， 充分混合并靜置20 min 后于560 nm 處測定吸光值[20，28-29]，每個(gè)處理3次重復(fù)。 吸光值越高，說明其中含膽固醇量越大。分別以未接種乳酸菌的含或不含膽鹽的MRSCHOL 培養(yǎng)基為對(duì)照測定其中的膽固醇總量。 未接菌的MRS-CHOL 中的膽固醇的量減去各菌株對(duì)應(yīng)上清液中膽固醇的量， 即為菌體降低膽固醇的量[30]，然后以此除以乳酸菌的生長量，即可得乳酸菌的膽固醇降低效力。 計(jì)算公式如下：

膽固醇降低效力（μg/u）=膽固醇降低量（μg）/乳酸菌生長量（u）

乳酸菌生長量（u）定義為測定乳酸菌降低效力的培養(yǎng)液的1 單位濁度值（即1 OD600）表示。

1.2.6 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 將優(yōu)良菌株活化擴(kuò)大培養(yǎng)后， 以2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中， 于37 ℃靜置培養(yǎng)， 每隔2 h 定時(shí)取樣，用測定發(fā)酵液在600 nm 處吸光值，3 次重復(fù)，然后繪制生長曲線和產(chǎn)酸曲線。

1.2.7 接種不同生長階段乳酸菌對(duì)降膽固醇的影響 將優(yōu)良菌株活化擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照2%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)，分別取菌株生長10 h 和20 h 時(shí)得培養(yǎng)液按2%體積比接種于MRS-CHOL 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，按照1.2.5 節(jié)測定優(yōu)選菌株發(fā)酵液中膽固醇含量，重復(fù)3 次。

1.2.8 耐酸性能 調(diào)節(jié)MRS 培養(yǎng)液pH 值來分析乳酸菌的耐酸能力。用0.1 N 的HCl 調(diào)節(jié)MRS 培養(yǎng)液的pH 分別為2.5，3.5，4.5，以自然pH 的MRS培養(yǎng)液作為對(duì)照[31]。優(yōu)選菌株在37 ℃培養(yǎng)至OD600為1 左右后按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于不同pH 的MRS 培養(yǎng)液中，分別測定培養(yǎng)0，2，4，6 h 時(shí)培養(yǎng)液中乳酸菌的細(xì)胞濃度。 存活細(xì)胞數(shù)按照稀釋平板計(jì)數(shù)法， 涂布于固體MRS 平板上，37 ℃培養(yǎng)24 ～48 h， 計(jì)算菌落形成單位CFU（Colony Forming Unit），3 次重復(fù)[32]。

1.2.9 乳酸菌耐受模擬胃腸道環(huán)境測試 乳酸菌對(duì)人工胃液[33]的耐受性參考Soundharrajan Ilavenil[34]。 人工胃液是將過濾除菌的胃蛋白酶（終質(zhì)量濃度為3 g/L）溶解在滅菌的0.5% NaCl 溶液中，并用0.1 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)pH 到2.0，2.5 和3.0[35]?；罨膬?yōu)選菌株按2%接種量轉(zhuǎn)接5 mL 新鮮的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至OD600約1.0。6 000 g 離心15 min 收集菌體， 用0.1%的蛋白胨水清洗一次，加入5 mL 人工胃液，重懸菌體后37℃靜置培養(yǎng)，按照稀釋平板計(jì)數(shù)法（同1.2.8 節(jié)）分別測定0，1，2，3，4 h 時(shí)培養(yǎng)物中的存活細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3 次。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 用Excel，SPSS 等軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法測定膽固醇方法的比較及膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法對(duì)膽固醇含量進(jìn)行測定，并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線（數(shù)據(jù)未提供）。在一定的檢測范圍內(nèi)， 兩種方法的檢測OD 值與膽固醇含量之間都顯示了良好的線性關(guān)系。 硫酸鐵銨法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.5476x+0.0167， 決定系數(shù)為0.9789。 采用此法測得培養(yǎng)基中膽固醇的添加回收率為92.67%；鄰苯二甲醛法所獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.2823x+0.0048，決定系數(shù)為0.9982，此法測得培養(yǎng)基中膽固醇的添加回收率可達(dá)到99.92%。比較兩種測定方法， 硫酸鐵銨法較鄰苯二甲醛法穩(wěn)定性和精確度略低，但其操作相對(duì)簡單，沒有危險(xiǎn)性，便于用來測定大批量數(shù)據(jù)，因此在初篩優(yōu)良菌株時(shí)采用此法。而鄰苯二甲醛法穩(wěn)定性更好，精確度更高， 但該方法不足之處在于試驗(yàn)中要進(jìn)行皂化、提取、真空抽干后才能進(jìn)行顯色，操作繁瑣，耗時(shí)長，而且其中用到了濃硫酸，具有一定的危險(xiǎn)性，不適于大批量樣本的測定，因此在菌株初篩之后，需要更為精準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析時(shí)采用。

2.2 降膽固醇乳酸菌的篩選

硫酸鐵法被用于從對(duì)30 株（其中融合魏斯氏菌（Weissella confusa），4 株，分別編號(hào)WS1～WS4；短乳桿菌 （Lactobacillus brevis），4 株， 分別編號(hào)LB1～LB4；食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），5 株，分別編號(hào)CW1～CW5； 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），17 株，分別編號(hào)LP1～LP17）從自然發(fā)酵食品中分離的乳酸菌中篩選具有降膽固醇能力菌株的篩選，各菌株的將膽固醇效果如表1。

從表1 可以看出， 不同的菌株降膽固醇的能力不同，即使是同種的不同菌株之間也存在差異。其中6 株菌的膽固醇降低率大于20%， 它們分別是WS1、LP2、LP3、LP4、LP5 和LP6，其降膽固醇效率分別達(dá)到34.06%，34.85%，30.61%，21.03%，28.73%和37.15%，6 株菌膽固醇降低率依次為LP6＞LP2＞W(wǎng)S1＞LP3＞LP5＞LP4，此6 株菌被選取進(jìn)行進(jìn)一步的其他性能和功能的分析和評(píng)價(jià)。

表1 30 菌株乳酸菌降膽固醇能力的分析Table 1 The analysis of cholesterol-lowering ability of 30 lactic acid bacteria

2.3 6 株降膽固醇能力較強(qiáng)菌株的耐膽鹽能力分析

人體腸道膽鹽濃度大概在0.03%～0.3%之間，當(dāng)乳酸菌隨食物進(jìn)入胃腸道后會(huì)面臨膽鹽的作用，為此，本研究對(duì)篩選出來的降膽固醇效果較好菌株進(jìn)行了耐膽鹽分析，如表2。

表2 6 株乳酸菌菌株的耐膽鹽性能分析Table 2 The analysis of bile salt resistance of the 6 lactic acid bacteria

從表2 可以看出6 株乳酸菌對(duì)不同的膽鹽濃度，表現(xiàn)出不同的耐受性，膽鹽濃度越高，耐受性越差， 不同的菌株對(duì)相同的膽鹽濃度， 也呈現(xiàn)差異。在0.1%的膽鹽濃度下，6 株菌生長性能都還可以， 其中WS1 最好， 耐受力為85.56%， 其次是LP6，耐受力為56.65%，而其他4 株菌耐受力依次為LP4 36.65%；LP2 32.77%；LP5 32.47%；LP3 32.01%。 當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到0.2%和0.3%時(shí)，24h 后各菌株依然能夠存活。隨著膽鹽濃度升高，菌株生長情況越來越差， 表明其收到膽鹽的抑制越來越明顯。 試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株均能適應(yīng)0.2%和0.3%膽鹽濃度的環(huán)境，24 h 后菌株仍有存活，結(jié)合人體腸道內(nèi)的膽鹽水平，0.2%的膽鹽濃度被用于后期的降膽固醇能力及其他特性檢測中。

2.4 6 株乳酸菌在含或不含膽鹽情況下降膽固醇效率和效力的分析

為了進(jìn)一步分析體內(nèi)膽鹽對(duì)乳酸菌降膽固醇的影響， 根據(jù)普遍模擬的腸道內(nèi)0.2%的膽鹽濃度，本研究對(duì)6 株乳酸菌在含0.2%和不含膽鹽的膽固醇MRS 培養(yǎng)基中降膽固醇的效率和效力進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 6 株乳酸菌在含0.2%和不含膽鹽培養(yǎng)基中的降膽固醇能力分析Fig.1 Analysis of cholesterol-lowering of 6 strains with or without 0.2% bile salt

結(jié)果顯示，在含0.2%膽鹽的培養(yǎng)基中，各菌株降膽固醇的效率和效力都明顯高于不含膽鹽的培養(yǎng)基。不同菌株的降膽固醇效率不同，在不含膽固醇的培養(yǎng)基中， 降膽固醇效率從高到低依次為LP6、LP2、WS1、LP3、LP5 和LP4；而在含膽鹽的培養(yǎng)基中， 降膽固醇效率從高到低依次為LP6、WS1、LP2、LP3、LP5 和LP4。 不同菌株的降膽固醇效力也具有差異，在不含膽固醇的培養(yǎng)基中，降膽固醇效力從高到低依次為WS1、LP2、LP5、LP6、LP3 和LP4；而在含膽鹽的培養(yǎng)基中，降膽固醇效力從高到低依次為WS1、LP6、LP2、LP3、LP4 和LP5。 在含膽鹽的培養(yǎng)基中，菌株降膽固醇效力的提升效果高于降膽固醇效率的提升效果， 間接反映了0.2%的膽鹽一方面對(duì)試驗(yàn)乳酸菌株具有一定的抑制作用， 另一方面膽鹽還可以促進(jìn)乳酸菌的降膽固醇能力。

將乳酸菌在含0.2%膽鹽的培養(yǎng)基中的降膽固醇效率和效力進(jìn)行綜合分析，結(jié)果如圖2。

圖2 0.2%膽鹽條件下6 株菌的降膽固醇效率和效力分析Fig.2 Efficiency and efficacy analysis of the 6 strains lowering cholesterol

由圖2 可以看出，在含0.2%的膽鹽的培養(yǎng)基中，無論是膽固醇降低效率還是膽固醇降低效力，WS1、LP6、LP2 和LP3 都比LP4 和LP5 要高，因此，本論文選擇WS1、LP6、LP2 和LP3 這4 株菌進(jìn)一步進(jìn)行其他生長特性和生理功能的分析。

2.5 復(fù)篩的4 株優(yōu)良乳酸菌菌株生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定

為了進(jìn)一步分析4 株復(fù)篩的優(yōu)良乳酸菌的生長特性和生理功能， 本論文對(duì)它們的生長曲線和產(chǎn)酸曲線進(jìn)行了分析，如圖3 所示。

圖3 4 菌乳酸菌菌株的生長曲線和產(chǎn)酸曲線Fig.3 Growth curves and acid-producing curves of 4 strains lactic acid bacteria

從圖3 可以看出，4 株優(yōu)良菌株WS1，LP2，LP3，LP6 的生長曲線基本相似，4 h 乳酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，同時(shí)大量產(chǎn)酸，pH 值有較大幅度降低，到18 h 之后開始進(jìn)入穩(wěn)定期，此后的生長曲線和pH 值曲線皆趨于平緩，直到24 h 左右。 這不僅為后面菌株耐酸性的研究中pH 的設(shè)置提供了依據(jù)， 也為后期分析不同的母種選擇時(shí)間對(duì)降膽固醇的影響提供了參考。

2.6 種子液的選取時(shí)機(jī)對(duì)降膽固醇的影響

為了分析從種子液中選取母種轉(zhuǎn)接時(shí)機(jī)對(duì)菌株降膽固醇能力的影響， 本研究分別選取了發(fā)酵液生長到10 h（對(duì)數(shù)期）和20 h 時(shí)（穩(wěn)定期）的培養(yǎng)物作為種子轉(zhuǎn)接到膽固醇MRS 培養(yǎng)液中，然后測定培養(yǎng)24 h 時(shí)菌株的降膽固醇效果，如圖4。

優(yōu)選菌株在不同生長階段轉(zhuǎn)接的母種， 經(jīng)過相同時(shí)間的培養(yǎng)后，由圖4 可以看出，它們對(duì)膽固醇的降低效率和降低效力各有不同。 但無論是降低效率還是降低效力， 轉(zhuǎn)接來自4 株菌對(duì)數(shù)期的種子液（10 h）均比來自穩(wěn)定期的種子液（24 h）的要高， 而且對(duì)數(shù)生長期的種子液表現(xiàn)的降低效力明顯高于穩(wěn)定期的種子液所對(duì)應(yīng)的降低效力，而兩者之間的膽固醇降低效率差別并不明顯， 盡管對(duì)數(shù)期的膽固醇降低率略高于非對(duì)數(shù)期。

圖4 不同生長期的種子液對(duì)菌株降膽固醇能力Fig.4 Cholesterol-lowering abilities of seed solution from different growth stage of the 4 strains

2.7 4 株優(yōu)良菌株的耐酸特性

本研究對(duì)復(fù)篩后的4 株優(yōu)良菌株在不同pH條件下（自然pH、pH 2.5、pH 3.5 和pH 4.5）的存活力進(jìn)行了分析， 菌株存活力通過測定0，2，4 和6 h 時(shí)的CFU/mL 來顯示，如圖5。

圖5 4 株菌在不同pH 值下的存活力Fig.5 The viability of the 4 strains under different pH

4 株復(fù)篩菌株在不同pH 的培養(yǎng)基中，在不同的培養(yǎng)時(shí)段，其存活力不同。 pH 2.5 時(shí)，培養(yǎng)到2 h 時(shí)，4 株菌的存活力降低速度非?？?， 幾乎降低105倍，2 h 后略微平緩，但是到4 h 時(shí)，菌數(shù)降為0，所取培養(yǎng)液無菌落形成。 pH 3.5 時(shí)，培養(yǎng)到2 h時(shí)，4 株菌的降低速度都較pH 2.5 的速度慢，大概降低103～104倍，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，培養(yǎng)液中活細(xì)胞數(shù)繼續(xù)減少，到6 h 時(shí)，各菌株檢測不到活菌。 而對(duì)于pH 4.5 和自然pH 條件下，菌體在2 h時(shí)，菌株存活力略有降低，到4 h 和6 h 時(shí)，菌株存活力又開始慢慢上升，但pH 4.5 的總是低于自然pH 的存活力。 結(jié)果說明，pH 低于3.5 時(shí)，4 株菌的生長會(huì)受到較為強(qiáng)烈的抑制。 而高于4.5 時(shí)，菌株可以較好地存活。

2.8 4 株復(fù)篩菌株在模擬胃腸道的存活率分析

人體胃部的pH 一般為2.7 左右，腸道為5.5，而食物在胃里滯留時(shí)間為3 h 左右。 因此，如果菌株能夠順利通過胃部進(jìn)入腸道， 它們將會(huì)比較容易存活并發(fā)揮益生菌的功能。在此，本研究進(jìn)一步對(duì)菌株在模擬胃腸道環(huán)境（人工胃酸）下，在不同時(shí)間的存活力進(jìn)行了分析， 對(duì)人工胃酸作用的分析分別設(shè)定了pH 2、pH 2.5 和pH 3 下在0，1，2，3 和4 h 時(shí)的處理?xiàng)l件，如圖6。

圖6 顯示， 在3 種pH 條件下，4 株菌的數(shù)量都在減少，pH 越低， 降低速度越快， 對(duì)于1 010 CFU/mL 左右的初接種量，在4 h 時(shí)，各菌株依然有102～108的細(xì)胞存活。 pH 3 條件下的存活力高于pH 2.5 的，pH 2.5 的又高于pH 2 的，高pH 值條件下，4 菌株存活率明顯增強(qiáng)。 試驗(yàn)結(jié)果表明，4菌株在人工胃酸中， 在3～4 h 均具有一定的耐受性。

圖6 4 菌株在人工胃酸中的存活力Fig.6 The survival of 4 strains in simulated gastric acid

3 結(jié)論

大量的研究發(fā)現(xiàn)， 許多乳酸菌具有降膽固醇功能，包括羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌及長雙歧桿菌等[36]。在本研究中，4 種菌的30 個(gè)菌株被用于檢測其降膽固醇能力，結(jié)果顯示， 不同的菌種， 甚至同一菌種的不同菌株之間，其降膽固醇效率及效力存在差異，這可能與菌株本身的特性有關(guān)，具體的原因尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。本研究中最終篩選出了2 種菌，融合魏斯氏菌（Weissella confusa）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）中4 個(gè)菌株具有良好的降膽固醇功能，其中融合魏斯氏菌為首次報(bào)道。

本研究中， 測定膽固醇含量分別采用硫酸鐵銨法和鄰苯二甲醛法，通過數(shù)據(jù)分析來看，盡管鄰苯二甲醛法所測得數(shù)據(jù)偏小， 但是大體的趨勢和硫酸鐵銨法所得數(shù)據(jù)在趨勢上保持一致，因此，在待測樣品較多，或者需要耗時(shí)縮短時(shí)，可以采用硫酸鐵銨法，如果需要更為精確和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，還是建議采用鄰苯二甲醛法。

當(dāng)培養(yǎng)基中含有膽鹽時(shí)， 乳酸菌的存活力下降，0.1%的膽鹽情況下， 乳酸菌的耐受性尚可，但是當(dāng)膽鹽濃度高于0.2%時(shí)，乳酸菌的耐受性急劇降低。 在0.2%膽鹽存在情況下，盡管存活力下降了， 但是其降膽固醇效率和效力都提高了， 如圖1，這說明膽鹽對(duì)乳酸菌降膽固醇具有促進(jìn)作用。4株優(yōu)選乳酸菌的生長特性和產(chǎn)酸特性顯示它們穩(wěn)定性很好，耐酸性的分析表明，當(dāng)pH 4.5 時(shí)，菌株的穩(wěn)定性和常規(guī)pH 時(shí)的一致， 隨著pH 值降低，它們的耐受性越來越差。 對(duì)耐人工胃酸的結(jié)果表明，乳酸菌在其中的耐受性似乎要強(qiáng)于在調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基中的耐受性。盡管如此，但是乳酸菌在人工胃酸中的存活力下降還是比較明顯。因此，如何保證乳酸菌能順利地通過胃部已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

降膽固醇乳酸菌若要用于人體健康的維護(hù)，其必須具有良好的耐酸，耐膽鹽特征，這樣才能保證它們順利通過胃和十二指腸， 以一定的有效數(shù)量進(jìn)入到腸道中， 為人體提供有效的健康支撐作用。 當(dāng)前人們已經(jīng)在添加益生元[37]、適當(dāng)介質(zhì)或者選擇合適的包被材料[38]、載體材料來提高乳酸菌的存活力方面進(jìn)行了大量的研究[39]，研究的成果也被逐漸用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

本研究表明， 所篩選的4 株乳酸菌在體外具有膽固醇降低能力，并具有一定的耐酸性、耐膽鹽特性，這為今后的應(yīng)用準(zhǔn)備了合適的應(yīng)用菌株，也為研究乳酸菌降膽固醇機(jī)制打下了基礎(chǔ)并準(zhǔn)備了研究材料。