氧化鋁柱層析純化蛋黃多不飽和脂肪酸卵磷脂及其脂肪酸組成分析

龔金炎 靳羽曉 王靜靜 李歸浦 何光華 袁海娜 李 玲劉士旺 尤玉如 肖功年*

（1 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 杭州310023 2 貝因美嬰童食品股份有限公司 杭州310053）

卵磷脂即磷脂酰膽堿（PC）是動(dòng)植物細(xì)胞膜的基本組分。 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）對(duì)生物膜和機(jī)體的正常生理活動(dòng)與代謝有重要調(diào)節(jié)功能，主要包括花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，具有良好的乳化、分散、粘著等特性[1-3]，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健、化妝品、飼料等行業(yè)中[4-5]。許多科研組織和權(quán)威機(jī)構(gòu)包括聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織及世衛(wèi)組織建議成人從飲食中攝入的EPA 和DHA 總量應(yīng)在250 mg/d～2 g/d 之間[6]。 嬰兒配方食品中的總脂肪酸應(yīng)該包含至少0.2% DHA 和0.35% ARA。 隨著人們對(duì)保健養(yǎng)生的日益重視，市場(chǎng)上對(duì)高純度PC 的需求逐年增加。我國(guó)高純度PC 的生產(chǎn)技術(shù)水平相對(duì)落后， 特別是富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的高純度PC，主要靠進(jìn)口，貿(mào)易逆差巨大[7]。 進(jìn)一步優(yōu)化PC生產(chǎn)工藝， 開發(fā)出富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸高純度的PC 產(chǎn)品，對(duì)滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求具有重要意義。

目前，我國(guó)PC 分離純化方法主要有：有機(jī)溶劑萃取法、乙醇冷凍法、超臨界流體法、金屬鹽沉淀法、膜分離法及柱色譜法等[8-10]。 國(guó)內(nèi)已有學(xué)者[11-14]采用氧化鋁層析柱純化制備高純度PC，而未對(duì)柱層析過(guò)程中的影響因素進(jìn)行考察。 本試驗(yàn)以90%乙醇為萃取劑制備的PC 粗品為原料，結(jié)合薄層層析法和高效液相色譜對(duì)95%乙醇洗脫P(yáng)C 的分離純化工藝進(jìn)行研究， 并通過(guò)氣相色譜法對(duì)所得產(chǎn)品進(jìn)行脂肪酸分析，以期為PC 的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋黃卵磷脂粗品， 實(shí)驗(yàn)室自制 （PC 純度為71.63%±2.73%）；蛋黃卵磷脂標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）P3556、37 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、 異辛烷（AR），sigma 公司；氯仿、無(wú)水乙醇、三乙胺、甲醇、丙酮、氫氧化鉀、硫酸氫鈉均為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；100～200 目中性氧化鋁、200～300 目中性氧化鋁，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁基羥基茴香醚，購(gòu)自Aladdin （阿拉?。?；甲醇色譜純，德國(guó)默克色譜純?cè)噭┕尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

層析柱（Φ2.6 cm×60 cm），上海廈美生化科技發(fā)展有限公司；BT50S 蠕動(dòng)泵，保定雷弗流體科技有限公司；循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 東京理化器械株式會(huì)社； 低溫恒溫槽， 上海百典儀器設(shè)備有限公司；UPK-1-5T 優(yōu)普系列超純水器，成都超純科技有限公司；AB135-S 十萬(wàn)分之一電子天平，METTLER TOLEDOG；F254（5 cm×10 cm）硅膠板，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠出品； GC-2014，配有FID 檢測(cè)器，日本島津公司；Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)，配有Waters 2489 檢測(cè)器，美國(guó)waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料制備 稱取一定質(zhì)量的蛋黃粉，以90%乙醇濃度液料比9∶1（V/m），30 ℃條件下提取30 min，過(guò)濾后，濾液50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，0 ℃丙酮超聲洗脫，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 層析柱準(zhǔn)備 稱取一定質(zhì)量氧化鋁， 置于140 ℃烘箱內(nèi)活化6 h，干燥器中冷卻至室溫；稱取適量活化后的氧化鋁， 加入95%乙醇洗脫液浸泡2 h，濕法裝柱后，靜置過(guò)夜使其自然沉降完全。 上柱前需要調(diào)至所需條件，平衡30 min 以上。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 薄層層析法 （TLC）將硅膠板置于105℃烘箱中活化2 h， 干燥器中冷卻至室溫備用；所需測(cè)定樣品分別點(diǎn)樣；層析缸中使用展開劑（氯仿∶無(wú)水乙醇∶三乙胺∶水= 10∶11.3∶11.7∶2.7）展開8 cm， 晾干后， 溴百里酚藍(lán)染液均勻噴于薄板表面，通風(fēng)櫥晾干，可見淺綠色斑點(diǎn)，并確定相同Rf值為同一物質(zhì)。

1.3.3.2 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)方法 色譜柱：安捷倫ZORBAX RX-SIL（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：206 nm，柱溫：35℃；流動(dòng)相A：甲醇∶水（8∶1）；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫：0～6 min，60%～48% A，40%～52% B；6.01～10 min，60% A，40% B。

1.3.3.3 氣相檢測(cè) （GC）方法 色譜柱：DIKMA DM-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm），具體操作方法參見GB 5009.168-2016。 分流比調(diào)整為30∶1。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 稱取一定質(zhì)量蛋黃卵磷脂試樣上樣后，不同濃度乙醇洗脫，以每0.5 BV （0.5倍柱體積）單位收集，利用TLC 快速定性和HPLC定量分析相結(jié)合跟蹤。 填料量為270 g 氧化鋁，固定其他條件，分別考察上樣量（4，6，8，10 g）、上樣濃度（w/v）（1∶4、1∶10）、 洗脫液濃度（90%乙醇、95%乙醇、純乙醇）、流速（4，6，8 mL/min）及固定相粒度（100～200 目、200～300 目）等因素對(duì)PC 純化過(guò)程的影響，每組試驗(yàn)平行3 次。

1.3.5 最優(yōu)條件下洗脫效果的檢測(cè)和脂肪酸分析在最優(yōu)條件下：洗脫劑濃度為95%乙醇，上樣量為0.0222 g/g 氧化鋁 （6 g）， 洗脫流速為8 mL/min，上樣濃度為1∶4（m/V）。 對(duì)洗脫液進(jìn)行分段收集濃縮、經(jīng)氮?dú)獯蹈桑?0 ℃），由高效液相色譜檢測(cè)PC 含量和氣相色譜分析脂肪酸種類， 每組測(cè)量3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層層析結(jié)果

分別對(duì)PC 粗品、PC 標(biāo)品、前期洗脫液和后期洗脫液進(jìn)行點(diǎn)板顯色，結(jié)果見圖1。 圖中顯示柱層析純化效果明顯， 粗磷脂中的5 種磷脂成分得到了有效分離，可得到純度較高的PC 產(chǎn)品；同時(shí)也可以看出后期洗脫液中，PC 以外的其它雜質(zhì)。

圖1 薄層層析結(jié)果Fig.1 Thin layer analysis results

2.2 PC 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算樣品卵磷脂含量， PC 含量與色譜峰面積關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 2 782.6X+228 753，R2=0.9983， 在0.078～2.5 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 固定相粒徑對(duì)洗脫過(guò)程影響 以100～200目和200～300 目的中性氧化鋁為填料， 以確定固定相粒徑對(duì)洗脫過(guò)程的影響。

由圖2 可知，200～300 目的氧化鋁吸附能力更強(qiáng)，PC 洗出時(shí)間稍晚；200～300 目氧化鋁較100～200 目的純化效果稍弱，這是由于PC 分子質(zhì)量處于600～700 u 左右，分子較大，所以孔容較大的吸附劑分離純化效果更好[15]。 另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化鋁粒徑為200～300 目時(shí)，由于填料粒徑小，層析柱裝填過(guò)于緊密，導(dǎo)致洗脫壓力增大，對(duì)蠕動(dòng)泵的壓力過(guò)大。綜合考量各種因素，選用氧化鋁填料的粒徑為100～200 目。

2.3.2 上樣濃度對(duì)洗脫過(guò)程的影響 上樣不同濃度1∶4 和1∶10（w/v），以確定不同上樣濃度對(duì)洗脫過(guò)程的影響。

由圖3 可知，在相同上樣量的前提下，上樣濃度越濃，洗脫帶越窄，越易洗脫；上樣濃度稀時(shí)，洗脫帶較寬，造成洗脫液的浪費(fèi)；濃度更大時(shí)溶解不完全。 因此，選取的上樣濃度為1∶4（w/v）。

2.3.3 不同上樣量對(duì)洗脫過(guò)程的影響 以4，6，8和10 g 為上載量，以確定不同上載量對(duì)洗脫過(guò)程的影響。

由圖4 可知，上載量為4 g 時(shí)，吸附劑太少，無(wú)法充分利用，浪費(fèi)層析柱填料，同時(shí)流動(dòng)相耗量太大，且產(chǎn)品干燥能耗大；而上載為10 g 時(shí)，上載量過(guò)大，TLC 結(jié)果顯示洗脫液無(wú)單一斑點(diǎn)，此時(shí)層析柱負(fù)載過(guò)大， 導(dǎo)致無(wú)法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的有效分離。上樣量為8 g 時(shí)，TLC 單一斑點(diǎn)較少，上載量為6 g 時(shí)單一斑點(diǎn)量最多， 此時(shí)分離效果最好。

2.3.4 洗脫流速對(duì)洗脫過(guò)程的影響 以4，6 和8 mL/min 為洗脫流速，確定不同洗脫流速對(duì)洗脫過(guò)程的影響。

圖2 不同中性氧化鋁粒徑洗脫曲線Fig.2 Elution curves of different diameter neutral alumina

圖3 不同上樣濃度洗脫曲線Fig.3 Different sample concentration elution curves

圖4 不同上載量時(shí)洗脫曲線Fig.4 The washout curve of different loads

圖5 不同洗脫流速時(shí)洗脫曲線Fig.5 Elution curve of different washout velocity

洗脫流速對(duì)于LPC 含量的控制起著至關(guān)重要的作用。 由圖5 可知， 洗脫流速為4 mL/min，TLC 結(jié)果顯示PC 單一斑點(diǎn)少且PC 洗脫時(shí)間較長(zhǎng)， 同時(shí)由于PC 在氧化鋁柱中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)有部分的PC 分解轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酰膽堿（LPC）[16]。當(dāng)洗脫流速在6 mL/min 及以上時(shí)，LPC 含量得到有效的控制。在同樣的洗脫效果下，洗脫流速應(yīng)選盡可能大， 以節(jié)省洗脫時(shí)間， 由于蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速限制，試驗(yàn)沒(méi)有做更高流速的考察，本試驗(yàn)的最佳洗脫流速選用8 mL/min。

2.3.5 不同洗脫劑濃度對(duì)洗脫曲線的影響 選用90%乙醇、95%乙醇和純乙醇為洗脫劑， 以確定不同洗脫流速對(duì)洗脫過(guò)程的影響。

由圖6 可知，當(dāng)以無(wú)水乙醇作為洗脫液時(shí)，氧化鋁活性很高，對(duì)磷脂的吸附作用太強(qiáng)，洗脫譜帶變寬， 造成洗脫液浪費(fèi)。 而當(dāng)洗脫液為90%乙醇時(shí)，由于洗脫液含水過(guò)多，氧化鋁的活性中心與水結(jié)合從而降低其活性， 且含水量過(guò)高產(chǎn)品難以干燥；當(dāng)活性降低到合適值時(shí)，可達(dá)到目標(biāo)物與雜質(zhì)的有效分離。 故本試驗(yàn)選用的95%乙醇純度為洗脫液。

2.4 最優(yōu)條件下洗脫效果

2.4.1 PC 產(chǎn)品含量和得率 由圖7 和表1 可知，蛋黃卵磷脂含量先升高后下降低，這是由于PC 在氧化鋁上吸附力較弱，比較容易洗脫，前期洗脫液中PC 含量較高；隨著洗脫液體積的增加，PC 逐漸被洗脫完全，其它磷脂如PE、PI 等隨之被洗脫，同時(shí)也有部分PC 分解成LPC[16]， 因此，PC 含量下降。

圖6 不同洗脫劑濃度時(shí)洗脫曲線Fig.6 Elution curve of different eluent concentration

圖7 最優(yōu)條件下洗脫曲線Fig.7 Optimal elution curve

圖8 HPLC 圖譜Fig.8 HPLC results of different samples

表1 最優(yōu)條件下層析產(chǎn)品結(jié)果Table 1 The optimal conditions for the analysis of product results

紫外檢測(cè)器具有選擇性， 只對(duì)具有π 鍵和孤對(duì)電子的物質(zhì)有響應(yīng)， 其響應(yīng)值因物質(zhì)所含官能團(tuán)及其官能團(tuán)連接方式的不同而異[17]。 蛋黃來(lái)源磷脂中脂肪酸組分常因家禽的品種和飼料中脂肪酸組分的不同而有所差異[18]，不同脂肪酸組分對(duì)紫外檢測(cè)的響應(yīng)差異很大，因此，采用UV 檢測(cè)蛋黃磷脂時(shí)會(huì)出現(xiàn)PC 含量大于100%的現(xiàn)象。 由試驗(yàn)結(jié)果隨著洗脫液體積的增加，PC 的純度及產(chǎn)量均有所降低。

2.4.2 PC 產(chǎn)品脂肪酸分析 由層析樣品的GC 檢測(cè)結(jié)果見表2，各段層析樣品中，脂肪酸種類大致相同，所有層析樣品均含有棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、 油酸、 反式亞油酸、 亞油酸、DHA、EPA、ARA。 各層析樣品中的飽和脂肪酸（SFA）含量隨洗脫時(shí)間的不同變化不大，含量在46%左右，其中棕櫚酸含量最高；隨著洗脫時(shí)間的增加，單不飽和脂肪酸（MUFA）含量逐漸增加，由一段產(chǎn)品27.40%增加到34.19%； 多不飽和脂肪酸（PUFA）含量逐步減少， 由一段產(chǎn)品的29.07%降到18.06%。 PUFA 主要由n3 及n6 多不飽和脂肪酸構(gòu)成其中主要的功能性脂肪酸有DHA、EPA、ARA，一段層析樣品中DHA 含量高達(dá)13.94%，該結(jié)果遠(yuǎn)高于其他禽蛋黃PC 中的檢測(cè)結(jié)果[19]，隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)DHA 含量逐漸減少， 由13.94%降至8.28%；ARA 變化趨勢(shì)與EPA 相似， 前三段樣品的ARA 含量變化有減少趨勢(shì)，由1.79%降到1.07%，EPA 含量由1.74%降至1.37%， 結(jié)果表明該方法可制得高純度PC 的同時(shí)， 還對(duì)FA 中的PUFA 組成有一定的篩選作用。

表2 不同層析產(chǎn)品脂肪酸組成GC 分析結(jié)果Table 2 Fatty acid composition of different chromatographic products meteorological analysis results

3 結(jié)論

采用以乙醇為洗脫劑， 研究中性氧化鋁層析制備高純度多不飽和脂肪酸蛋黃卵磷脂方法。 本試驗(yàn)采用的洗脫曲線能清晰表示出各條件下PC的洗脫效果， 試驗(yàn)過(guò)程中采用薄層層析法進(jìn)行定性分析，高效液相色譜法對(duì)洗脫液進(jìn)行定量分析，快速，簡(jiǎn)便，直觀，準(zhǔn)確。 試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳工藝條件為氧化鋁粒徑為100～200 目， 洗脫液為95%乙醇，洗脫流速為8 mL/min，色譜柱負(fù)載量為0.0222 g/g 氧化鋁， 上樣料液比為1∶4 條件下PC的純化效果最好，從71.63%±2.73%的蛋黃卵磷脂粗品純化得到純度達(dá)90%以上的卵磷脂得率達(dá)84.43%； 層析產(chǎn)品中的一段產(chǎn)品的PUFA 含量最高可達(dá)29.07%，其中DHA 的含量更是高達(dá)13.94%。該研究結(jié)果可為工業(yè)化制備高純度PC 以及高DHA 含量產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支撐和參考。