應(yīng)用高通量測序技術(shù)解析清香型大曲微生物多樣性

周 森 胡佳音 崔 洋 趙衛(wèi)鵬 張如今 白逢彥*

（1 北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠 北京101301 2 中國科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國家重點實驗室 北京101301）

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一， 具有悠久的歷史和深厚的酒文化內(nèi)涵[1]，其使用大曲作為發(fā)酵劑和糖化劑，經(jīng)過糖化、發(fā)酵、蒸餾和儲存等步驟制得。制曲技術(shù)是我國特有的一份民族遺產(chǎn)，它的出現(xiàn)代表了一個時代的進步， 當(dāng)制曲技術(shù)出現(xiàn)后，酒業(yè)就得到規(guī)模化、規(guī)范化、較先進的發(fā)展，從此酒就離不開曲，曲決定酒[2]。 俗語說：“有美酒必有佳曲[3]”，“曲為酒之骨[4]”的美譽，可見酒曲在白酒釀造中的重要性。

清香型白酒是我國白酒三大香型之一， 具有深厚的文化底蘊[5]。其特有的清香純正，醇甜柔和，自然諧調(diào)，余味爽凈等特點符合現(xiàn)代飲用要求，易與國際市場接軌，發(fā)展前景廣闊。

目前， 清香型白酒釀造用曲多采用低溫型大曲，其原料及生產(chǎn)流程基本相似。 可簡單歸納為：豌豆、大麥、小麥粉碎混合后加水踩曲制成曲塊，經(jīng)過臥曲、上霉、晾霉、潮火、干火、后火、養(yǎng)曲、貯曲等環(huán)節(jié)[6]。其生產(chǎn)過程是依靠自然界中帶入的各種微生物在淀粉質(zhì)原料中進行富集生長并繁殖擴大，不同的微生物形成了大曲的菌系結(jié)構(gòu)，其代謝生成的各種酶類構(gòu)成了大曲的酶系， 而不同地域微生物群落組成不同， 使得不同地域酒曲帶有明顯的地域特色。 認(rèn)識清香型大曲中不同曲種間微生物群落結(jié)構(gòu)與差異， 對于研究清香型白酒發(fā)酵具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)是指通過對微生物進行分離、純化和培養(yǎng)，來獲取微生物純培養(yǎng)的技術(shù)，該技術(shù)簡單易行， 可以獲得白酒中可培養(yǎng)微生物數(shù)量關(guān)系及活體菌株。 由于傳統(tǒng)白酒釀造屬于開放式操作，所以環(huán)境中大量微生物在固、氣、液相界面里進行復(fù)雜的物質(zhì)代謝， 經(jīng)過長期的馴化適應(yīng)了缺氧、高滲透壓、低pH 等特殊環(huán)境。 而在人工培養(yǎng)模式下，由于培養(yǎng)條件的差異，往往造成微生物之間共同協(xié)作的自然生存方式崩潰， 導(dǎo)致微生物可培養(yǎng)性不高[7]。 高通量測序（HTS）技術(shù)（又稱“第二代”測序（NGS）技術(shù)）[8-9]，不需要對樣品微生物進行分離、純化及培養(yǎng)，可以直接對樣品微生物群落結(jié)構(gòu)進行準(zhǔn)確分析， 是典型的微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)。目前，高通量測序技術(shù)已運用到各種分子生物學(xué)領(lǐng)域，如人體微生物、水中生物等方面及土壤中微生物群落研究等。 值得注意的是高通量測序往往檢測到的是樣品中所有DNA 序列，其中同樣包含微生物死亡后存留的DNA 片段，這些DNA 片段會對高通量實時性及準(zhǔn)確性造成一定影響。

本研究將傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，以北京、山西、臺灣、黑龍江、河北5 地的11 份清香大曲為研究對象，通過傳統(tǒng)分離方法獲得11 份大曲微生物的數(shù)量關(guān)系，并利用高通量測序技術(shù)分析11 份大曲真菌、細(xì)菌微生物的群落組成。將傳統(tǒng)分離與高通量分析相結(jié)合，確定了清香型大曲的優(yōu)勢菌群， 為進一步解析清香型大曲功能微生物，篩選優(yōu)良釀造微生物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品來源為北京、山西、臺灣、黑龍江、河北5地的11 家清香型酒廠的清香型低溫大曲。 其中，北京樣品2 種標(biāo)記為BJ-1、BJ-2， 山西樣品4 種標(biāo)記為SX-1-SX-4，臺灣樣品1 種標(biāo)記為TW，黑龍江樣品1 種標(biāo)記為HLJ， 河北樣品3 種標(biāo)記為HB-1-HB-3。

1.2 主要儀器

BSC-1100ⅡA2 型生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；1-14k 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；PLR-1006+4 ℃實驗室冰箱，賽墨飛世爾；FastPrep-24 樣品快速制備系統(tǒng)， 美國MP；基礎(chǔ)型水平電泳儀，美國BIORAD 公司；全自動凝膠成像儀，美國BIORAD 公司。

1.3 主要試劑

FastDNA SPIN Kit for Soil （MP bio 土壤基因組DNA 提取試劑盒）。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 YPD 酵母培養(yǎng)基 酵母浸粉10 g， 蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

1.4.2 PDA 絲狀真菌培養(yǎng)基 馬鈴薯浸提液500 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水500 mL。

1.4.3 MRS 乳酸菌培養(yǎng)基 牛肉膏10 g， 酪蛋白胨30 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺2 g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，七水合硫酸鎂0.58 g，一水合硫酸錳0.25 g，瓊脂12 g，水1 L。

1.4.4 孟加拉紅絲狀真菌培養(yǎng)基 北京奧博興外購。

1.4.5 芽孢桿菌肉汁培養(yǎng)基 蛋白胨10 g， 牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1 L。

1.5 清香型大曲微生物分離方法

大曲微生物種類較多， 其主要微生物大致可分為酵母菌、絲狀真菌、芽孢桿菌和乳酸菌這4 大類，采用稀釋涂布計數(shù)法，利用不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，可以較為準(zhǔn)確的分離出以上幾類微生物，其步驟如下：

將大曲樣品砸碎后混勻，采用四分法取樣。稱取大曲樣品10 g 置于裝有90 mL 無菌水的250 mL 三角瓶中，搖床振蕩30 min 使樣品充分混勻，制成菌懸液。

將菌懸液依次做10 倍遞減稀釋，選取適當(dāng)?shù)南♂屘荻纫?00 μL 涂布相應(yīng)平板中（每個樣品3個平行），涂布梯度、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如表1。

表1 微生物分離梯度及處理條件Table 1 Media， pretreatment and incubation conditions for the isolation of microbes from Daqu samples

計數(shù)方法： 一般選擇CFU （Colony-Forming Units）菌落形成單位在20～300 之間的平板進行計數(shù)。 在這個范圍之外則不能正確地指示樣品中微生物的真實數(shù)量。 具體計數(shù)原則如下：

為了避免虛假精確度的產(chǎn)生， 當(dāng)進行活菌計數(shù)時，保留一位有效數(shù)字，按照四舍五入原則對其進行取舍。

每毫升菌落形成的單位（CFU）=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

1.6 大曲總DNA 提取及高通量測序

稱取1g 大曲樣品，用Fastprep 處理后，根據(jù)FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒步驟提取大曲樣品總DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往北京奧維森公司，進行真菌ITS1 區(qū)、細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)高通量測序。 利用Illumina MiSeq PE300 進行高通量測序得到原始測序序列， 通過Fastqc 進行質(zhì)量檢測去除低質(zhì)量Reads （過濾標(biāo)準(zhǔn)：Q20 ≥90%）。 通過COPE 軟件（Connecting Overlapped Pair-End），進行序列拼接及過濾后利用Mothur 軟件以平均鄰近聚類算法（Average Neighbor Clustering Algorithm）在0.03（或97%的相似度）水平下對Clean Tags 進行OTU （operationaL taxonomic units）的聚類，統(tǒng)計各個樣品每個OTU 中的豐度信息。選取分析數(shù)據(jù)中每個OTU中一個有代表性的序列，通過Blast 比對，獲得每一個OTU 所代表的種名[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型大曲可培養(yǎng)微生物分菌結(jié)果

通過圖1 可以看出，11 種清香大曲微生物組成較為一致，真菌含量均比細(xì)菌高。不同大曲真菌和細(xì)菌數(shù)量及比例關(guān)系各不相同， 相互之間不具有規(guī)律性。

2.2 可培養(yǎng)真菌數(shù)量關(guān)系

本研究將清香型大曲中可培養(yǎng)真菌分為絲狀真菌和酵母菌兩大類。 扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是一種在大曲中廣泛存在的酵母，能夠采用肉眼進行區(qū)分，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和生香酵母（上述兩種之外所有酵母菌的總稱）形態(tài)差異較小易混淆，將這兩種酵母歸類為酵母菌進行整體分析。 因此在討論中將真菌劃分為絲狀真菌、扣囊覆膜酵母、酵母菌三大類進行分析。

通過圖2 可以看出，11 種大曲中扣囊覆膜酵母、絲狀真菌、酵母菌的數(shù)量各不相同，不具備規(guī)律性。但在真菌組成上較為一致，扣囊覆膜酵母在11 種大曲中均為主要真菌，絲狀真菌和酵母菌數(shù)量要小于扣囊覆膜酵母。 大曲中酵母菌只在SX-1、SX-3 和HLJ 中數(shù)量超過了絲狀真菌，其余樣品中均少于絲狀真菌， 整體看來其數(shù)量要少于絲狀真菌。

通過可培養(yǎng)真菌分離結(jié)果可以看出， 不同大曲微生物數(shù)量存在差異， 但大致可以確定出清香型大曲真菌微生物數(shù)量組成關(guān)系為： 扣囊覆膜酵母是主要真菌，其次為絲狀真菌，而酵母菌數(shù)量相對較少。

圖1 11 種大曲微生物計數(shù)結(jié)果Fig.1 The total of number of microbes in each of the 11 Daqu samples per gram

圖2 清香型大曲可培養(yǎng)真菌分離圖表Fig.2 Cultivable fungi isolated from light-flavor Daqu

2.3 可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量關(guān)系

本研究將清香大曲中可培養(yǎng)細(xì)菌分為乳酸菌和芽孢桿菌兩大類進行分析討論。

通過圖3 可以看出， 不同大曲中乳酸菌和芽孢桿菌數(shù)量之間存在較大差異且不具備規(guī)律性，如SX-1、HB-2、TW 大曲中乳酸菌數(shù)量要遠遠高于芽孢桿菌，SX-2、SX-3 大曲中芽孢桿菌數(shù)量卻又遠高于乳酸菌，HLJ 中乳酸菌與芽孢桿菌數(shù)量又相差不大。整體來看，在不同清香型大曲中，乳酸菌和芽孢桿菌分別構(gòu)成了細(xì)菌優(yōu)勢類群。

2.4 大曲ITS 區(qū)高通量分析

對11 種大曲樣品ITS 區(qū)進行數(shù)據(jù)處理后，共獲得290 種OTU， 主要包括酵母目（Saccharomycetales）、毛霉目（Mucorales）、散囊菌目（Eurotiales）、絲孢酵母目（Trichosporonales）。 挑選OTU 總數(shù)前13 的序列進行分析，結(jié)果如表2。

圖3 清香型大曲可培養(yǎng)細(xì)菌分離圖表Fig.3 Cultivable bacteria isolated from light-flavor Daqu

表2 清香型大曲ITS 區(qū)高通量測序分析結(jié)果Table 2 Composition of fungi in light-flavor Daqu samples based on high throughput ITS library sequence analysis

通過表3 數(shù)據(jù)可以看出， 這13 種真菌OTU可占大曲真菌OTU 總數(shù)的96.93%～99.64%，因而可以確認(rèn)其為清香大曲的主要真菌類群。 13 種真菌OTU 中包括絲狀真菌5 種， 分別為： 米曲霉（Aspergillus oryzae）、 謝瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、傘枝橫梗霉（Lichtheimia corymbifera）；酵母菌8 種，分別為：扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、庫氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、熱帶念珠菌（Candida tropicalis）、白地霉（Geotrichum candidum）、菱形伊薩酵母（Issatchenkia scutulata）、異常威克酵母（Wickerhamomyces anomalus）= 異常漢遜酵母 （Hansenula anomala）、 阿薩希絲孢酵母（Trichosporon asahii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

整體來看， 雖然不同大曲真菌的組成比例各不相同，但是主體真菌均為扣囊覆膜酵母，其在不同大曲樣品中所占比例在51.48%～98.32%之間。庫氏畢赤酵母是OTU 總數(shù)第二的真菌，其在不同大曲樣品中所占比例在0.37%～30.87%之間。排在其后的是5 種絲狀真菌， 在所有大曲樣品中均有出現(xiàn)，但數(shù)量較少，只在個別大曲數(shù)量較多。 而其余的7 種酵母菌在大曲中數(shù)量更少或無法檢測到。

2.5 大曲細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)高通量分析

11 種大曲樣品V3-V4 區(qū)進行數(shù)據(jù)處理后，共獲得305 種OTU，主要包括乳桿菌目（Lactobacillales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、假諾卡氏菌目（Pseudonocardiales）、鏈霉菌目（Streptomycetales）， 挑選OTU 總數(shù)前15 的序列進行分析，結(jié)果如表3。

表3 清香型大曲細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)高通量測序分析結(jié)果Table 3 Composition of bacteria in light-flavor Daqu samples based on 16S rDNA V3-V4 region library high throughput sequence analysis

通過表3 高通量數(shù)據(jù)可以看出，15 種細(xì)菌OTU 可占大曲細(xì)菌OTU 總數(shù)的68.8%～91.2%，因而初步確定其為清香大曲的主要細(xì)菌類群。 15 種細(xì)菌OTU 可分為五大類， 分別為乳酸菌10 種包括：融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、短乳桿菌 （Lactobacillus brevis）、 黑龍江乳桿菌（Lactobacillus heilongjiangensis）、 彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、 舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）；芽孢桿菌1 種為：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；泛菌屬1 種為：成團泛菌（Pantoea vagans）；葡萄球菌1 種為：雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）； 放線菌2 種為： 白色鏈霉菌（Streptomyces albus）、 克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia eburnea）。

整體來看，清香型大曲細(xì)菌組成較為多樣化，不具備明顯優(yōu)勢種， 但通過高通量數(shù)據(jù)可以看出在大曲細(xì)菌多樣性組成中乳酸菌類在種類和數(shù)量上均處于優(yōu)勢地位。 其中數(shù)量較多的乳酸菌主要為魏斯氏菌（W. confuse）、戊糖片球菌（P. pentosaceus）、檸檬明串珠菌（L. citreum）、耐酸乳桿菌（L. acetotolerans）。

成團泛菌、地衣芽孢桿菌、雞葡萄球菌、白色鏈霉菌、 克羅彭斯特菌屬這5 種細(xì)菌在大曲樣品中均有出現(xiàn)，并且在某些樣品中占有較高的比例，但整體從數(shù)量和種類分析， 這幾類細(xì)菌均無法同乳酸菌類相比。

3 討論

大曲作為釀酒的糖化發(fā)酵劑， 一直以來備受企業(yè)重視，多年來，人們不斷地研究制曲，改良制曲工藝，使制曲工藝逐步走向規(guī)范化。但由于制曲過程屬于生料制曲、自然接種[11]。 即原料沒有經(jīng)過滅菌， 而且菌種還可來自制曲環(huán)境中的空氣和工具，涉及的微生物種類和數(shù)量都極為復(fù)雜，造成了微生物的多樣性， 至今尚未完全研究透徹曲中各種微生物及酶在釀酒發(fā)酵過程中的作用機理。

本研究利用傳統(tǒng)分離方法結(jié)合rDNA 高通量測序技術(shù)對北京、山西、臺灣、黑龍江、河北5 地的11 份清香大曲微生物進行系統(tǒng)研究。 研究結(jié)果表明：傳統(tǒng)分離結(jié)果中11 份大曲樣品中微生物數(shù)量各不相同，真菌總數(shù)遠大于細(xì)菌總數(shù)。在真菌組成中， 扣囊覆膜酵母是11 份大曲樣品的主要真菌，其數(shù)量遠高于絲狀真菌和其他酵母菌， 不同大曲之間絲狀真菌和酵母菌數(shù)量比例關(guān)系各不相同，總體來看酵母菌數(shù)量要小于絲狀真菌。 在細(xì)菌組成中，大曲的優(yōu)勢細(xì)菌存在差異，乳酸菌和芽孢桿菌分別構(gòu)成了不同大曲的優(yōu)勢細(xì)菌類群。

rDNA 高通量測序數(shù)據(jù)分析表明，在真菌多樣性中， 大曲中真菌類群主要由扣囊覆膜酵母和庫氏畢赤酵母2 種酵母組成， 其中扣囊覆膜酵母是大曲中優(yōu)勢真菌類群，其可占大曲樣品的51.48%～98.32%，這與傳統(tǒng)分離結(jié)果較為一致。 而絲狀真菌整體數(shù)量較少， 只在某1 種或2 種大曲中占有一定的比例。在細(xì)菌多樣性中，大曲中細(xì)菌類群主要由乳酸菌、芽孢桿菌、泛菌屬、放線菌這4 大類組成。乳酸菌在種類和數(shù)量上處于優(yōu)勢地位，主要種類為融合魏斯氏菌、 戊糖片球菌、 檸檬明串珠菌、耐酸乳桿菌。

本研究利用傳統(tǒng)微生物分離技術(shù)確定了大曲中微生物數(shù)量關(guān)系， 通過高通量測序獲得了不同大曲的微生物多樣性組成， 將兩種分析手段相結(jié)合，明確了清香大曲真菌和細(xì)菌的數(shù)量關(guān)系、微生物多樣性及優(yōu)勢種群分布。 雖然兩種分析方法在整體結(jié)果上較為一致， 但在某些方面存在一定差異， 如兩種方法中酵母菌和絲狀真菌比例關(guān)系差異較大， 這是否由于常規(guī)培養(yǎng)條件下該菌較難分離或絲狀真菌孢子較多、菌絲茂盛，影響分離效果所造成， 或是由于在大曲制作過程中某一節(jié)點該菌大量生長后死亡，殘留的大量DNA 未降解從而影響了高通量數(shù)據(jù)造成， 這還需進一步驗證。 同時，在今后大曲微生物研究中，可對傳統(tǒng)分離微生物進行分子鑒定后再與高通量數(shù)據(jù)進行對比，這樣可使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確。