雞白痢沙門菌減毒候選疫苗株的環(huán)境應(yīng)激評(píng)價(jià)及主要生物學(xué)特性測定

王艷琳，滿成連，馮 政，陳素娟，秦 濤，彭大新

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省家禽疫病防控工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州225000)

雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pullorum)可以通過水平傳播和垂直傳播而引起雛雞的雞白痢，造成較高的發(fā)病率和死亡率[1-3]。該病在我國雞群中分布較廣，其也是《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》確定的優(yōu)先防治病種。由于抗生素的使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增加，疫苗免疫成為凈化該病的重要手段。減毒疫苗較滅活疫苗而言，不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，而且還能產(chǎn)生細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答。因此，研制雞白痢沙門菌減毒疫苗成為近年來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。生物被膜(Biofilm)是細(xì)菌在生長過程中附著在物體表面形成的膜樣復(fù)合物[4]，可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的耐受力。卷曲菌毛是生物被膜的主要成分之一，其結(jié)構(gòu)亞基csgA由操縱子csgBAC合成，缺失后會(huì)影響生物被膜形成[5]。ompR基因是EnvZ/OmpR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，缺失該基因后的細(xì)菌不能分泌外膜蛋白OmpF，影響菌體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力[6]，其也可以與CsgD啟動(dòng)子結(jié)合間接影響細(xì)菌生物被膜的形成。

本實(shí)驗(yàn)室前期基于λ-Red同源重組系統(tǒng)在S6702△rfaG和S6702△rfaL單基因缺失株基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列雞白痢沙門菌雙基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA和三基因缺失株、S6702△rfaG△csgA△ompR、 S6702△rfaL△csgA△ompR，免疫效力試驗(yàn)結(jié)果顯示這些缺失株均具有較好的免疫保護(hù)作用和體內(nèi)安全性[7]。但由于活菌會(huì)隨動(dòng)物體向環(huán)境外排放，對(duì)生物安全造成潛在的風(fēng)險(xiǎn)，因此開展減毒候選疫苗株的生物安全評(píng)價(jià)不可或缺。因此本研究對(duì)上述缺失株開展了生物被膜形成能力測定、酸堿、溫度、紫外線環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及兩種消毒劑滅活效果試驗(yàn)，判定各菌株在不同環(huán)境中的生存能力，為疫苗侯選株的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株 雞白痢沙門菌野生菌株S6702由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，雞白痢沙門菌基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL、S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR、S6702△rfaL△csgA△ompR由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。腸炎沙門氏菌活疫苗Sm24由羅曼公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑 DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；結(jié)晶紫(Crystal Violet)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB購自Fluka公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、氯化鈉、純化瓊脂粉等均購自國藥集團(tuán)；衛(wèi)可過硫酸氫鉀復(fù)合物粉由英國安德國際有限公司生產(chǎn)；中牧金碘聚維酮碘溶液由中牧南京動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 生長曲線的測定 將野生沙門菌S6702、單基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL、雙基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA以及三基因缺失株 S6702△rfaG△csgA△ompR和 S6702△rfaL△csgA△ompR于37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1.5 h檢測一次培養(yǎng)物的OD600nm值，連續(xù)測定8次，共計(jì)12 h，重復(fù)3次試驗(yàn)，最后將所得數(shù)據(jù)利用GraphPad prism軟件繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.4 沙門菌生物被膜形成的檢測 參照Pratt等方法[8]，挑取野生沙門菌S6702及6株基因缺失株的單個(gè)菌落分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min過夜震蕩培養(yǎng)，利用1∶10 TSB培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋各菌液后接種于96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板，對(duì)照組接種100 μL無菌1∶10 TSB培養(yǎng)基，置28℃靜置培養(yǎng)72 h后，取出培養(yǎng)板，棄菌液，利用結(jié)晶紫溶液每孔100 μL避光染色20 min，在培養(yǎng)板底部形成生物被膜環(huán)，倒出培養(yǎng)板內(nèi)液體，超純水洗滌3遍，利用乙醇丙酮溶液溶解沉積于培養(yǎng)板底部的生物被膜環(huán)，利用酶標(biāo)儀測定各菌的OD550nm值。每次試驗(yàn)重復(fù)2個(gè)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次取其平均值。

1.5 環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn) 將野生菌株S6702、腸炎沙門菌疫苗菌株Sm24與6株基因缺失株在LB平板于37℃靜置培養(yǎng)24 h后挑取若干單菌落全板均勻劃線于LB瓊脂平板上，37℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期(約6 h)，用含15%甘油的PBS將LB平板上的細(xì)菌全部刮下，放置于指形管中，12 000 r/min離心10 min，再用15%甘油PBS洗滌2～3次，調(diào)節(jié)菌液OD600nm=0.4，作為后期試驗(yàn)的初始菌液。

參照Han等[9]方法，取 100 μL OD600nm=0.4的各菌株菌液順次加入900 μL pH分別為7.2、6.0、5.0和4.0的LB肉湯和pH為7.2和8.0的Tris-Cl中，置于37℃震搖培養(yǎng)30 min作為實(shí)驗(yàn)組，以各菌株在pH為7.2的LB(中性LB)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)做為對(duì)照組，檢測各菌株對(duì)酸堿的耐受能力。

選取OD600nm=0.4的各菌株菌液100 μL分別置于900 μL的pH為7.2的LB肉湯培養(yǎng)基中，54℃震搖培養(yǎng)3 min作為實(shí)驗(yàn)組，將相應(yīng)菌株置于37℃震搖培養(yǎng)3 min作為對(duì)照組，檢測各菌株對(duì)高溫的耐受能力。

選取OD600nm=0.4的菌液1 mL置于9 mL的pH為7.2的LB肉湯培養(yǎng)基中，并均勻散布于無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下25 cm處分別照射2 min和5 min作為實(shí)驗(yàn)組，將各相應(yīng)菌株菌液開蓋置于白熾燈25 cm處處理5 min作為對(duì)照組，

經(jīng)不同環(huán)境處理后的菌液離心后收集菌體，使用15%甘油PBS洗滌并重懸，10倍倍比稀釋后涂布于麥康凱平板，培養(yǎng)18 h后菌落計(jì)數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散K-B法[10]檢測雞白痢沙門菌野生菌株S6702、6株基因缺失株和腸炎沙門氏菌活疫苗株Sm24對(duì)7種常見藥物的敏感性試驗(yàn)。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI/NCCLS)2005年標(biāo)準(zhǔn)，腸桿菌科耐藥抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)為諾氟沙星、慶大霉素、氯霉素≤12 mm；卡那霉素、萘啶酸≤13 mm；四環(huán)素≤14 mm、環(huán)丙沙星≤15 mm。

1.7 消毒劑滅活效果試驗(yàn) 初始菌液的準(zhǔn)備同1.5，衛(wèi)可過硫酸氫鉀粉劑根據(jù)參考使用說明按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 配置，商品化聚維酮碘溶液稀釋至濃度為0.1%和0.01%。參照Guo等試驗(yàn)方法[11]，分別取野生菌株S6702、腸炎沙門菌疫苗株Sm24與6株基因缺失株OD600nm為0.4的各菌株菌液各100 μL置于900 μL的上述不同濃度的各消毒劑溶液中，于37℃震蕩培養(yǎng)5 min，立即離心收集菌體，經(jīng)15%甘油PBS洗滌并重懸，10倍倍比稀釋后涂布于麥康凱平板，培養(yǎng)18 h后菌落計(jì)數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理 各試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Graphpad prism軟件繪制圖像并經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 各菌株生長曲線的測定結(jié)果 同時(shí)對(duì)野生菌株S6702及6株基因缺失株進(jìn)行生長曲線的測定。結(jié)果顯示，與野生菌株S6702相比，所有的基因缺失株的生長速度均未出現(xiàn)顯著變化(p＞0.05)，且基因缺失株的生長曲線具有明顯的對(duì)數(shù)生長期(圖1)，表明rfaL、csgA和rfaG基因的缺失不影響細(xì)菌的生長能力，可以滿足疫苗株的研制需要。

2.2 各菌株生物被膜形成能力的測定結(jié)果 在96孔板中以結(jié)晶紫染色定量法測定各菌株的生物被膜形成能力。結(jié)果顯示單基因缺失株S6702△rfaG、S6702△rfaL的OD550nm與野生菌株S6702相比稍有降低，但無顯著差異(p＞0.05)，而雙基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA和三基因缺失株S6702△rfaG△csgA△ompR、S6702△rfaL△csgA△ompR的生物被膜形成能力較野生菌株S6702則顯著降低(p＜0.01)(圖2)。結(jié)果表明，缺失生物被膜相關(guān)基因csgA或/和ompR后雞白痢沙門菌喪失了生物被膜的形成能力。

2.3 各菌株對(duì)環(huán)境應(yīng)激的試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)各菌株進(jìn)行酸耐受試驗(yàn)，結(jié)果顯示當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH=6.0時(shí)，三基因缺失株S6702△rfaG△csgA△ompR和S6702△rfaL△csgA△ompR的存活率較在pH=7.2的中性LB中的存活率有所降低，其余基因缺失株和野生菌株的存活率與在中性LB培養(yǎng)基中相比有所上升；當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH=5.0時(shí)，疫苗株Sm24和單基因缺失株S6702△rfaG的存活率與在中性LB培養(yǎng)基中相比無顯著差異(p＞0.05)，其余菌株的存活率均開始下降；當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH為4.0時(shí)，所有被測菌的存活率均開始顯著下降(p＜0.01)，其中基因缺失株的存活率較野生菌株S6702和疫苗株Sm24的更低(p＜0.001)(圖 3A)。

堿耐受試驗(yàn)中，與pH=7.2的中性LB對(duì)照組和pH=7.2的Tris-Cl中相比較，各菌株的存活率在pH為8.0的Tris-Cl中時(shí)均呈現(xiàn)指數(shù)下降趨勢。疫苗株Sm24和6株基因缺失株的存活率較野生菌株S6702更低(p＜0.001)(圖3B)。表明，雙基因缺失株和三基因缺失株均對(duì)pH=4.0的酸性培養(yǎng)條件和pH=8.0的堿性培養(yǎng)條件較野生菌株更敏感，且呈現(xiàn)出了微耐酸和不耐堿的生物學(xué)特性。

54℃處理3 min后的各菌存活率變化結(jié)果顯示，疫苗株Sm24的存活率為其37℃對(duì)照組的48.2%，野生菌株S6702及各基因缺失菌株的存活率為各自對(duì)照組的19%～38.2%(圖3C)，各實(shí)驗(yàn)組與37℃對(duì)照組各菌株存活率均差異顯著(p＜0.01)，表明各菌株的生長在54℃條件下均能夠被有效抑制。

紫外應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果顯示各菌株在紫外線照射后存活率較對(duì)照組均顯著降低(p＜0.01)。紫外線照射2 min后各菌株存活率為各自對(duì)照組的33.7%～69.5%，紫外照射5 min后各菌株存活率為各自對(duì)照組的17.9%～35.2%(圖3D)，各菌株存活率隨著紫外線照射時(shí)間的延長而下降，表明生產(chǎn)實(shí)踐中利用紫外線照射滅活環(huán)境中殘留活菌的方案是可行的。

2.4 各菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 為評(píng)估基因缺失突變對(duì)雞沙門氏菌耐藥性的影響，選擇了7種抗生素對(duì)該菌野生菌株S6702、6株基因缺失株及腸炎沙門氏菌疫苗株Sm24的耐藥性進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，各菌株對(duì)7種抗生素的敏感性均較高，野生菌株S6702與其基因缺失株之間耐藥性相似(表1)，表明各基因缺失并未改變雞白痢沙門菌的耐藥性。

2.5 消毒劑對(duì)各菌株滅活效果的檢測結(jié)果 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉劑的消毒效果顯示，其對(duì)野生菌株S6702的有效滅活濃度為1:50，對(duì)單基因缺失株的有效滅活濃度為1∶100，對(duì)多基因缺失株的有效滅活濃度為1∶200，對(duì)疫苗株Sm24的滅活濃度為1∶400(圖4A)。聚維酮碘溶液的消毒效果顯示，0.1%的稀釋濃度即可滅活測定的所有菌株(圖4B)。表明，兩種不同成分的消毒劑均能夠滅活被測菌株，但缺失生物被膜形成能力的雙基因缺失和三基因缺失株對(duì)過硫酸氫鉀的敏感性更高，生物安全性更好。

3 討論

目前我國養(yǎng)禽業(yè)的養(yǎng)殖形式多樣，養(yǎng)殖規(guī)模參差不齊，生物安全體系尚不健全，導(dǎo)致沙門菌的污染較為嚴(yán)重，而雞白痢沙門菌垂直傳播等生物學(xué)特性使得雞白痢的防控更為困難。截至目前，成熟的商品化雞白痢疫苗尚未出現(xiàn)。脂多糖(Lipopolysac-charides，LPS)是合成沙門菌等革蘭氏陰性菌外膜的重要成分，也是細(xì)菌發(fā)揮毒力的重要因子。吳白等通過同源重組方法構(gòu)建的LPS相關(guān)基因缺失株S6702△rfaL和S6702△rfaG不僅毒力降低，免疫原性高，而且具有DIVA(Differentiation of infected and vaccinated animals)特性[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期在該基因缺失株基礎(chǔ)上構(gòu)建的csgA和/或ompR基因缺失株均失去生物被膜形成能力，在毒力降低的基礎(chǔ)上對(duì)環(huán)境適應(yīng)的能力下降，其具備更好的生物安全性。本實(shí)驗(yàn)通過生長曲線的測定結(jié)果顯示，雙基因缺失株在普通LB培養(yǎng)基中的生長速度與野生菌株相似，三基因缺失株生長速度略慢于野生菌株，但基因缺失株均可以滿足制備疫苗所需的劑量。

表1 野生菌株和缺失株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

環(huán)境應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門菌在酸堿耐受試驗(yàn)中表現(xiàn)出了微耐酸和不耐堿的特性，這可能與雞白痢沙門菌的感染途徑相關(guān)。消化道是沙門菌侵入機(jī)體的主要感染途徑，為抵抗胃酸環(huán)境，沙門菌能夠激活自身的酸耐受應(yīng)答反應(yīng)(Acid tolerance response，ATR)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示培養(yǎng)基的pH為8.0時(shí)，各沙門菌活菌數(shù)已呈指數(shù)下降的趨勢。在熱應(yīng)激和紫外耐受試驗(yàn)中，各菌株的增殖能力均能夠被有效抑制。各方面環(huán)境應(yīng)激結(jié)果均顯示，生物被膜合成相關(guān)基因ompR和/或csgA缺失菌株的環(huán)境適應(yīng)力下降，在環(huán)境中更易被滅活，具備更高的生物安全特性。

喹諾酮類藥物曾廣泛應(yīng)用到家禽沙門菌感染的治療，但近年來，由于不合理的使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。沈欣悅等對(duì)2013年華東地區(qū)分離的禽源沙門菌耐藥分析結(jié)果顯示，高達(dá)90%的分離株均對(duì)喹諾酮類抗菌藥之一的萘啶酸有抗性[14]。本研究選擇的7種藥物分別來自喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和酰胺醇類，試驗(yàn)結(jié)果顯示基因缺失株對(duì)萘啶酸和選擇的其它藥物均高度敏感，與野生菌株是一致的，并未因基因的缺失而改變菌株的耐藥性。

綜上所述，雞白痢沙門菌基因缺失株S6702△rfaG△csgA、S6702△rfaL△csgA、S6702△rfaG△csgA△ompR和 S6702△rfaL△csgA△ompR均喪失了生物被膜形成能力，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力下降，在酸、堿、54℃熱處理、紫外照射條件下均易被滅活，對(duì)兩種常用消毒劑聚維酮碘和過硫酸氫鉀也顯示出了較高的敏感性，具有良好的環(huán)境安全性，可以作為雞白痢沙門菌減毒候選疫苗株的潛力。