PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

施開創(chuàng)，王睿敏，黎宗強(qiáng)*，謝守玉，尹彥文，陸文俊，屈素潔

(1.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005)

傳染性腹瀉是仔豬的常見疾病，該病是導(dǎo)致仔豬死亡的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。其中，豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、 豬 德 爾 塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PRoV)是主要病原[2-4]。這4種病毒均可以導(dǎo)致高度傳染性的腸道疾病，以厭食、嘔吐、腹瀉和脫水為主要特征，臨床癥狀和病理剖檢變化極為相似，難以區(qū)分，加上多種病原的混合感染、繼發(fā)感染非常普遍[5-6]，給臨床及時(shí)、準(zhǔn)確診斷帶來很大困難。因此，本研究針對PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了同時(shí)檢測并區(qū)分這4種病毒的多重?zé)晒舛縍T-PCR方法，為這4種疾病的檢測提供了有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床病料樣品 PEDV疫苗株(CV777株)、TGEV疫苗株(H株)、PDCoV分離株(GX1701株)、PRoV疫苗株(NX株)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)疫苗株(TJM-F92株)、豬偽狂犬病病毒(PRV)疫苗株(Bartha-K61株)、豬口蹄疫病毒(FMDV)O型疫苗株(O/Mya98/XJ/2010株)、豬細(xì)小病毒(PPV)疫苗株(N株)、豬瘟病毒(CSFV)疫苗株(C株)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)疫苗株(SX07株)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

243份臨床腹瀉樣品，包括腹瀉仔豬的糞便拭子、病豬和死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物，于2018年采集自廣西各地發(fā)生腹瀉的豬場。

1.2 主要試劑 Mini Plasmid Kit、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1ststrand cDNA SynthesisKit、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、EcoRⅠ、HindⅢ、pMD18-T載體、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的PEDV(AF353511)、TGEV(DQ811789)、PDCoV(JQ065042)、PRoV(FJ617209)參考株基因序列，分別設(shè)計(jì)4對特異性引物及相應(yīng)的TaqMan熒光探針(表1)，用于擴(kuò)增PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因、PRoV VP6基因。引物和探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的引物及探針序列

1.4 臨床樣品的處理及基因組的提取 糞便拭子加入含1 mL pH7.2 PBS液的滅菌離心管內(nèi)，反復(fù)振蕩1 min，5 000 r/min離心10 min，取上清；剪取小腸組織，加入含適量(W/V，1:4)pH7.2 PBS液的滅菌離心管中搗碎后反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清。按照RNA/DNA抽提試劑盒說明書抽提樣品上清中總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取PEDV CV777株、TGEV H株、PDCoV GX1701株、PRoV NX株病毒液抽提總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別以其為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的4對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥铡⒓兓疨CR產(chǎn)物，分別連接至pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，篩選陽性克隆并增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別命名為pPEDV-N、 pTGEV-M、 pPDCoV-M、 pPRoV-VP6。應(yīng)用核酸蛋白分析儀測定濃度，計(jì)算拷貝數(shù)：拷貝數(shù) =質(zhì)粒濃度×6.02×1023/(660×質(zhì)粒總長度)。

1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6作為模板，應(yīng)用4對特異性引物和Taq-Man探針，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行多重TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增，采用方陣實(shí)驗(yàn)分別對退火溫度(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃)、引物濃度(終濃度分別為 0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL)和探針濃度(終濃度分別為 0.2 pmol/μL、 0.3 pmol/μL、 0.4 pmol/μL、 0.5 pmol/μL)進(jìn)行優(yōu)化，在Ct值≤35個(gè)循環(huán)時(shí)判定結(jié)果，以獲得TaqMan熒光定量PCR的最佳反應(yīng)條件。

將4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成2.06×109拷貝 /μL～2.06×103拷貝 /μL 后分別作為模板，按照優(yōu)化的TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 取 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV和 FMDV病毒液，利用RNA/DNA抽提試劑盒抽提總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；取 PCV2、PPV和 PRV病毒液，利用 RNA/DNA抽提試劑盒抽提總DNA。以上述cDNA和DNA為模板，設(shè)重組質(zhì)粒作為陽性對照，雙蒸水為陰性對照，利用所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測，評價(jià)其特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 將4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pPEDVN、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6進(jìn)行10倍系列稀釋，選取終濃度為2.06×109拷貝/μL～2.06×100拷貝/μL的質(zhì)粒等比例混合物作為模板，利用建立的TaqMan熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)其敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 將4種重組質(zhì)粒pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6分別10倍系列稀釋后等比例混合，取3個(gè)濃度梯度(終濃度分別為2.06×108拷貝 /μL、2.06×106拷貝 /μL、2.06×104拷貝/μL)質(zhì)?；旌衔?，利用建立的TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；經(jīng)同樣方法對不同批次提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)。評價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測 利用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的多重RT-PCR方法[7]以及本研究所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法對1.4中提取的243份臨床樣品基因進(jìn)行檢測，比較兩者檢測PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的結(jié)果，計(jì)算二者符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 提取PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV病毒液總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，應(yīng)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PEDV N基因(140 bp)、TGEV M基因(102 bp)、PDCoV M基因(72 bp)、PRoV VP6基因(107 bp)片段，與各自目的片段大小一致(圖略)。經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化，陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，結(jié)果顯示與預(yù)期一致。表明構(gòu)建了4種重組質(zhì)粒，分別命名為pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6，經(jīng)檢測濃度，換算成拷貝數(shù)依次為 2.57×1010拷貝 /μL，2.62×1010拷貝 /μL、3.43×1010拷貝 /μL、4.67×1010拷貝 /μL，將其分別作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 多重TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的確定 經(jīng)過優(yōu)化，多重TaqMan熒光定量RT-PCR的最佳反應(yīng)體系為25 μL：Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，PEDV-N和PRoV-VP6上、下游引物(25 pmol/μL)及探針(25 pmol/μL)各 0.5 μL(終濃度 均 為 0.50 pmol/μL)，TGEV-M 和 PDCoV-M 上 、下游引物(25 pmol/μL)及探針(25 pmol/μL)各 0.3 μL(終濃度均為 0.30 pmol/μL)，模板 2 μL，滅菌雙蒸水5.7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃20 s；95℃1 s，58℃45 s，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光信號。

2.3 多重TaqMan熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M和pPRoV-VP6質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋成2.06×109～2.06×103拷貝/μL，等比例混合后作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得多重TaqMan熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。結(jié)果顯示，4種標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.998以上，表明各種標(biāo)準(zhǔn)品的起始模板數(shù)和Ct值之間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4 特異性分析 以 PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV的 cDNA和 PCV2、PPV和PRV的DNA為模板，以滅菌雙蒸水為陰性對照，利用建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR進(jìn)行特異性檢測。結(jié)果顯示，只有作為陽性對照的pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M、pPRoV-VP6質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以及以PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的cDNA出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而且Ct值均小于35個(gè)循環(huán)，其余病毒的cDNA或DNA以及陰性對照均無擴(kuò)增曲線(圖2)。表明所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.5 敏感性分析 將pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-M和pPRoV-VP6質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋后等比例混合作為模板，結(jié)合循環(huán)數(shù)進(jìn)行多重Taq-Man熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，循環(huán)數(shù)在35以下時(shí)，該方法對pPDCoV-M的檢出下限為2.06×101拷貝 /μL、對 pPEDV-N、pTGEV-M 的檢出下限為 2.06×102拷貝/μL、對pPRoV-VP6的檢出下限為2.06×103拷貝/μL(圖 3)。表明該方法具有較高的敏感性。

2.6 重復(fù)性分析 對所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)均小于1.1%(表2)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 臨床樣品的檢測結(jié)果 利用所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法，對2018年采集自廣西各地的243份臨床腹瀉病料樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重RT-PCR方法[7]對相同病料進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3，經(jīng)計(jì)算分析兩種方法檢測樣品陽性結(jié)果的符合率為96.71%。表明本研究所建立的多重TaqMan熒光定量RT-PCR可以用于臨床檢測，臨床存在這4種病原的混合感染，應(yīng)引起重視。

表2 多重TaqMan熒光定量RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

表3 臨床腹瀉樣品的檢測結(jié)果

3 討論

由PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV引起的仔豬臨床癥狀和病理解剖變化極為相似，并且混合感染和繼發(fā)感染普遍，給臨床診斷造成極大困難[8-9]，需要利用實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)鑒別病原。熒光定量RT-PCR具有靈敏、高效、可定量、高通量、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在病原學(xué)檢測中得到廣泛應(yīng)用。Seong等[10]、侯月娥等[11]建立了同時(shí)檢測TGEV、PEDV的多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法，許夢怡[12]、劉鄧等[13]、李軍[14]等建立了PEDV、TGEV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法，羅尚星等[15]建立了PDCoV、PEDV多重TaqMan熒光定量 RT-PCR方法，張利衛(wèi)等[16]建立了 PDCoV、PEDV多重SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，陳小金等[17]、吳洋等[18]建立了PEDV、TGEV、PRoV多重SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法。但是，迄今未見同時(shí)檢測并區(qū)分PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR方法的報(bào)道。本研究針對PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和PRoV VP6基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法。應(yīng)用該方法檢測采集自廣西的243份臨床樣品，檢出陽性樣品96份(42.79%)，其中TGEV陽性樣品38份(15.64%)、PEDV陽性樣品 29份(11.93%)、PRoV陽性樣品23份(9.47%)、PDCoV陽性樣品22份(9.05%)，并且混合感染陽性樣品8份(3.29%)。近年，許夢怡檢測采自江蘇省的40份臨床病料，結(jié)果顯示TGEV陽性2份(5%)、PEDV陽性12份(30%)、PRoV陽性5份(12.5%)，其中TGEV和PEDV混合感染1份(2.5%)、PEDV和PRoV混合感染2份(5%)[12]。羅尚星等檢測采自河北省的130份仔豬腹瀉樣品，結(jié)果顯示PDCoV檢出率為16.9%，PEDV檢出率為66.2%，二者混合感染的檢出率為2.3%[15]。張利衛(wèi)等檢測采自河南省的198份腹瀉樣品，結(jié)果顯示PDCoV陽性率為20.7%、PEDV陽性率為29.8%、PDCoV和PEDV混合感染率為8.6%[16]。趙津等報(bào)道，云南省47份仔豬腹瀉病料中PEDV、TGEV、PRoV的陽性率分別為 55.32%、6.38%、14.89%[19]。任玉鵬等報(bào)道，四川省222份仔豬腹瀉病料中PEDV、TGEV、PDCoV的陽性率分別為52.2%、2.7%、2.3%[20]。同時(shí)，均存在多種病原的混合感染。以上結(jié)果表明，PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV在仔豬中普遍存在，且檢出率在國內(nèi)不同地域有所差異，但以PEDV為主，同時(shí)PDCoV、TGEV、PRoV也很普遍，不容忽視。

本研究建立了PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR鑒別檢測方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，為4種病毒的快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。