艾灸對壓瘡大鼠皮膚組織中eNOS蛋白表達的調(diào)控作用*

韓 超,孫忠人

(1.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院,廣東 深圳 518101；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001)

壓瘡(pressure ulcer)又稱壓力性潰瘍,是指人體皮膚組織因活動不便而長期受壓，引起局部缺血、缺氧而最終導(dǎo)致的皮膚損傷[1]。壓瘡給患者帶來了嚴(yán)重的疾病痛苦和昂貴的醫(yī)療費用，已成為臨床護理工作中急需解決的難題。目前對壓瘡的治療還是以藥物外用為主[2]，但存在療效反復(fù)的問題，如何結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)療法進行疾病的治療相關(guān)研究，正成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點。艾灸療法作為中醫(yī)學(xué)特色療法，因其具有溫通經(jīng)脈和行氣活血的功效，可扶補人體正氣，改善氣血運行，已有在臨床中應(yīng)用于壓瘡的治療報道。壓瘡干預(yù)的本質(zhì)是創(chuàng)傷修復(fù)的血管新生，而這一過程與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白密切相關(guān)[3]，所以本實驗采用HE染色和免疫組化法觀察壓瘡大鼠皮膚組織的變化，通過艾灸對組織形態(tài)學(xué)和eNOS蛋白的影響，探討艾灸在促進壓瘡修復(fù)過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雌性SD大鼠共50只，體質(zhì)量220～250 g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(實驗動物許可證編號：SYXK 2016004)。實驗過程中對動物處置均符合動物實驗福利標(biāo)準(zhǔn)和動物實驗倫理標(biāo)準(zhǔn)?？瞻捉M10只，運用先造模后分組的方法，將余下40只SD大鼠先進行缺血-再灌注壓瘡造模，造模成功后按照隨機數(shù)字表法，分為模型組、艾灸組、模型抑制劑組和艾灸抑制劑組，每組各10只大鼠。相同條件下常溫單籠飼養(yǎng)。

1.2 造模方法

本造模裝置為實驗團隊自制裝置,見圖1，所造模型為改進的缺血-再灌注模型[4](Rats Pressure Ulcer Model by Ischemia-Reperfusion,RPUMIR)。通過已知目標(biāo)壓強P值(150 mmHg)和模型創(chuàng)面面積S值(即螺釘下端面積1 cm2)，可通過壓力計算公式(F=PS)算出壓力(通過放置相應(yīng)重量的鋼珠實現(xiàn))。壓力確定后，將大鼠仰臥固定于鐵架上，近膝關(guān)節(jié)骨隆突處進行脫毛處理。將裝置垂直放置大鼠身上，使螺釘下端壓于近膝關(guān)節(jié)骨隆突處，使受壓處缺血并保持2 h，后移開裝置使造模處不受壓，進行再灌注0.5 h，再灌注期間將大鼠放回單籠，自由飲水進食，如此為1個循環(huán)，每天進行5個循環(huán)，共進行3天，即可完成模型制備。

圖1 自制壓瘡造模裝置

1.3 主要儀器及試劑

顯微圖像釆集系統(tǒng)(日本Nikon公司)；LDZ4-0.8臺式離心機(北京京立公司)；CX41奧林巴斯顯微鏡(日本Olympus公司)； Anti-eNOS antibody(武漢博士德生物工程有限公司)；wortmannin抑制劑(美國Selleck公司)；二甲基亞砜DMSO(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組化試劑盒(丹麥DAKO抗體生產(chǎn)商)；DAB顯色劑(丹麥DAKO抗體生產(chǎn)商)；Wortmannin抑制劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；DMSO(碧云天生物技術(shù)研究所)；無煙艾條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司)；艾灸造模及治療裝置(實驗團隊自制)。

1.4 干預(yù)方法

空白組：腹腔注射等量生理鹽水(1.4 mg/Kg)，相同條件下抓取固定15 min。模型組：每日干預(yù)前，給予等量生理鹽水腹腔注射(1.4 mg/Kg)，仰臥位固定15 min。艾灸組：每日干預(yù)前，給予等量生理鹽水腹腔注射(1.4 mg/Kg)。仰臥位固定，進行艾灸治療，應(yīng)用回旋灸操作，艾條燃燒端距創(chuàng)面中心3 cm，每次治療15 min，每日治療1次。模型抑制劑組：每日干預(yù)前，腹腔注射wortmannin 1.4 mg/Kg，仰臥位固定15 min。艾灸抑制劑組：每日干預(yù)前，腹腔注射wortmannin 1.4 mg/Kg。艾灸操作同艾灸組。

各組大鼠每天干預(yù)1次，療程為10天。艾灸治療過程中，通過皮溫儀實時觀測艾灸溫度，艾灸溫度控制在(42±1)℃范圍內(nèi)。及時測量并記錄創(chuàng)面局部溫度；處理艾條燃燒產(chǎn)生的艾灰，避免因艾灰跌落創(chuàng)面引起壓瘡表皮負損傷。

1.5 取材方法及檢測流程

在治療10天后對各組大鼠進行取材，根據(jù)大鼠體重配置(350 mg/Kg)10%的水合氯醛并記放入包埋框，后投入甲醛溶液中保存。取完標(biāo)本的大鼠給予脫頸椎處死。

HE染色觀察方法[5]：①二甲苯脫蠟，將切片置于二甲苯中浸泡10 min×2次；梯度酒精脫水，無水乙醇，浸泡1 min×3次；95%乙醇，浸泡1 min；85%乙醇，浸泡1 min；75%乙醇，浸泡1 min。②1×PBS 洗5 min，共3次。③蘇木精染色5 min，自來水洗10 min。④1%鹽酸酒精分化5 s，蒸餾水洗10 min。⑤伊紅染色5 min，自來水洗30 s。⑥無水乙醇5 min×2次。⑦二甲苯5 min×3次。⑧中性樹膠封片。⑨每張切片在400倍光鏡下采集10個視野的圖像，為更鮮明示意各種細胞分布趨勢，HE染色圖示均以×200倍光鏡下采集的視野作為示例。

免疫組化觀察方法[5]：①石蠟包埋及切片：將組織放入盛有石蠟的模具中，擺好位置，冷卻。切片機切片，切片厚度為3～5 μm黏附在防脫處理的玻片上。②脫蠟和水化：二甲苯脫蠟，將切片依次置于二甲苯、梯度乙醇及去離子水中浸泡。③抗原修復(fù)：切片浸入0.01 M枸櫞酸緩沖液，加熱至沸騰，冷卻后反復(fù)操作兩次，自然冷卻至室溫。④阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將切片置去離子水中浸泡1 min×3次;圈定玻片上待測組織區(qū)域，PBS溶液沖洗2 min×3次;后在圈定區(qū)域內(nèi)加適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10～15 min，PBS溶液沖洗2 min×3次。⑤封閉：滴加5%BSA封閉液，室溫封閉1 h，甩去多余液體。⑥孵育I抗，滴加稀釋后的I抗，eNOS(1∶100)，4℃恒溫過夜,PBS溶液沖洗2 min×3次。⑦孵育II抗：滴加經(jīng)稀釋的辣根酶標(biāo)記II抗，室溫孵育30 min,PBS溶液沖洗2 min×3次。⑧顯色，滴加適量配置好的DAB顯色劑，室溫5 min左右。⑨復(fù)染，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染10～30 s，1%鹽酸分化，自來水沖洗返藍。脫水、透明、封片。讀片及結(jié)果判定：采用Image Pro Plus圖像分析軟件(Version 6.0)，每張切片隨機采集400×圖像6張。選取有效指標(biāo)積分光密度值(Integrated Optical Density，IOD)進行半定量分析，即IOD =∑(OD×Area)。當(dāng)細胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或黃棕色顆粒表達時即為陽性。

Western Blot觀察法：①蛋白樣品制備：液氮中取出腦組織放入預(yù)冷研缽充分短時研磨，加入蛋白裂解液至研缽沖洗研磨好的組織，充分混勻后將懸液放入EP管中，使用前加蛋白酶抑制劑。②BCA蛋白法定量：將懸液放在冰上冰浴20 min，確保裂解充分，離心20 min后收集上清。采用BCA蛋白定量試劑盒定量檢測各標(biāo)本總蛋白。③稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：將測定好濃度的細胞裂解液與4×sample buffer混勻，置于100℃沸水中5 min，低速離心3～5 s，室溫冷卻，將蛋白marker和樣品依次加到凝膠的上樣孔中，空余的上樣孔用1×sample buffer補齊。④SDSPAGE電泳：預(yù)先將PVDF膜在甲醇中浸泡5～10 min，使之激活，采用濕法將凝膠轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)夾中，注入 transfer buffer，在冰上以200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。⑤封閉及雜交：將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入雜交袋中，再加入3%的BSATBST封閉液，置于翻轉(zhuǎn)儀上平緩翻轉(zhuǎn)，封閉2 h。后將PVDF膜與抗體稀釋液置于雜交袋中孵育過夜。用TBST對PVDF膜進行洗滌。將二抗用3%的BSA-TBST封閉液稀釋，并與PVDF膜置于雜交袋中，孵育1.5 h。⑥曝光：按照ECL增強發(fā)光液試劑盒的說明書配制曝光液，向PVDF膜上滴加顯色曝光。⑦結(jié)果采用Quantity One圖像分析軟件進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組HE染色比較

空白組大鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，復(fù)層鱗狀上皮組織層次清晰，無明顯炎癥細胞浸潤。各造模組大鼠壓瘡創(chuàng)面組織，復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)不清，肌纖維水腫明顯，大量炎癥細胞浸潤。模型組創(chuàng)面組織出現(xiàn)少許肉芽組織；創(chuàng)面可見上皮細胞，肉芽組織中炎性細胞以巨噬細胞為主，創(chuàng)面底部出現(xiàn)成纖維細胞。艾灸組壓瘡創(chuàng)面被正常上皮細胞覆蓋，并被新生毛囊完全填充，毛囊下存在少量修復(fù)組織，新生組織中存在大量成纖維細胞，成纖維細胞較模型組排列緊密。艾灸抑制劑組部分被肉芽組織填充，毛細血管較豐富，創(chuàng)面已有上皮覆蓋，但較艾灸組生長緩慢。模型抑制劑組創(chuàng)面面積減小，略可見肉芽組織，創(chuàng)面底部可見巨噬細胞，創(chuàng)面但無新生毛囊。見封三彩圖2。

2.2 各組eNOS蛋白表達比較

eNOS蛋白在皮膚組織的中性粒細胞﹑內(nèi)皮細胞、成纖維細胞均有表達，陽性表達為棕黃色或黃色顆粒樣。干預(yù)10天后，eNOS組別表達量差異如下：空白組表達量較其他4組相對較少；模型組IOD值高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，艾灸組表達量IOD值較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明艾灸可以提高壓瘡組織中eNOS蛋白表達。艾灸抑制劑組干預(yù)較模型組有緩慢增加趨勢，但表達量顯著低于艾灸組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示特異性抑制劑wortmannin有阻斷eNOS表達的影響；模型抑制劑組表達均低于模型組，存在顯著性差異。見表1、封三彩圖3。

表1 各組eNOS蛋白表達情況 (OD值，

注：與空白組比較,#P<0.05；與模型組比較,*P<0.05；與艾灸組比較,★P<0.05。

2.3 各組p-eNOSs1117蛋白表達比較

Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),p-eNOSs1117/β-actin空白組表達最少。模型組磷酸化eNOS表達均高于空白組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，艾灸組p-eNOSs1117/β-actin表達值因有艾灸作用干預(yù)而有相對較高表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時表達值在5組中為最高表達。艾灸抑制劑組和模型抑制劑組表達分別低于艾灸組(P<0.05)和模型組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明,艾灸可以上調(diào)eNOS蛋白表達，促進血管新生，而特異性抑制劑wortmannin的應(yīng)用則會PI3K/Akt信號通路，抑制艾灸作用。見表2、圖4。

表2 各組大鼠p-eNOSs1177/β-actin表達情況(OD值，

注：與空白組比較,#P<0.01；與模型組比較,*P<0.05,▲P<0.01;與艾灸組比較,★P<0.05。

圖4 各組p-eNOSs1177蛋白在大鼠皮膚組織中的表達( Western Blot)

3 討論

壓瘡因其昂貴的防治成本與漫長的治療時間，是長期困擾護理工作中的常見問題，如何通過科學(xué)的研究方法，模擬壓瘡的形成機制，并從中探索干預(yù)壓瘡的有效方法，已成為現(xiàn)今臨床科研工作者的研究熱點[6]。壓瘡修復(fù)的本質(zhì)是血管新生，而這一過程與血管內(nèi)皮細胞作用密切相關(guān)。艾灸療法作為中醫(yī)療法，具有改善循環(huán)和創(chuàng)傷修復(fù)等作用，本研究在前期實驗中已有觀察，艾灸療法可以有效促進創(chuàng)面愈合、促進內(nèi)皮細胞增殖、提高平均血流灌注量[7]，但缺乏分子生物學(xué)相關(guān)研究，所以本研究在PI3K/Akt信號通路層面進行了以上具體研究。

血管內(nèi)皮細胞生成因子(VEGF)是已得到廣泛證實的促血管生長因子，在與血管內(nèi)皮細胞相應(yīng)受體結(jié)合后可介導(dǎo) PI3K/Akt信號通路，促進血管網(wǎng)絡(luò)重建[8]。PI3K/Akt信號通路作為調(diào)節(jié)細胞存活與凋亡的重要傳導(dǎo)通路，在誘導(dǎo)細胞凋亡、存活、增殖和遷移方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。壓瘡中皮膚損傷的實質(zhì)是細胞凋亡[9]，而PI3K/Akt信號通路在被激活后會與下游信號分子Akt發(fā)生激活效應(yīng)，使其磷酸化，而磷酸化Akt則進一步對eNOS的調(diào)控，可以通過促進NO的生成，為微血管新生提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)能夠生成NO而發(fā)揮廣泛的生物調(diào)節(jié)作用，能夠在皮膚損傷中發(fā)揮細胞增殖、炎癥調(diào)節(jié)以及血管生成等多種作用[10]。eNOS在激活后，會促進單核細胞、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的生成和增殖，改善傷口局部血液循環(huán)[11]。eNOS蛋白檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組eNOS雖呈低水平表達，但提示與機體已啟動皮膚損傷應(yīng)對機制，生成少量eNOS表達對創(chuàng)面修復(fù)進行調(diào)節(jié)作用；與模型組相比，艾灸組eNOS表達值有相對較高表達，證實艾灸可以上調(diào)eNOS表達量，為皮膚損傷愈合提供營養(yǎng)及內(nèi)環(huán)境[12]。艾灸抑制劑組因使用特異性抑制劑wortmannin從而阻斷艾灸治療功效，所以表達低于艾灸組。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),艾灸可以通過激活eNOS蛋白，促進大量NO生成，增加血管舒張等作用[13]，為損傷皮膚的修復(fù)提供營養(yǎng)，加速壓瘡修復(fù)。

艾灸因具有行氣活血和溫經(jīng)通絡(luò)的作用，已在臨床中用于損傷組織的治療[14]。研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6等細胞因子，改善損傷皮膚的炎癥浸潤程度，調(diào)整自由基代謝失衡，對糖尿病皮膚潰瘍大鼠的創(chuàng)面愈合發(fā)揮關(guān)鍵作用；同時，艾灸還對巨噬細胞的吞噬能力具有調(diào)節(jié)作用，增強吞噬能力可促進殺傷病原體，促進巨噬細胞的自噬性更新，利于組織損傷的修復(fù)。向麗婷等[15]研究發(fā)現(xiàn),艾灸可通過迷走神經(jīng)通路修復(fù)應(yīng)激性胃黏膜損傷大鼠；楊嬌等[16]指出,艾灸燃燒時產(chǎn)生的揮發(fā)油是促進創(chuàng)面愈合的有效成分，因為揮發(fā)油可以調(diào)節(jié)中性粒細胞的數(shù)目，減輕炎性組織凋亡和水腫，對創(chuàng)面愈合有促進作用。多數(shù)文獻證實，艾灸作用不僅局限在改善循環(huán)和免疫調(diào)節(jié)，同時還在損傷修復(fù)、抗病毒、鎮(zhèn)痛等領(lǐng)域有大量研究空間。

筆者認為，研究壓瘡的修復(fù)機制，一定要從促進血管新生的角度出發(fā)。艾灸療法作為具有溫經(jīng)活血功能的中醫(yī)療法，可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路下游的eNOS因子發(fā)揮作用。而艾灸能否對該通路下其他因子如bad或caspase-9產(chǎn)生影響，或通過VEGF介導(dǎo)的其他下游通路發(fā)揮作用，是今后探索艾灸在促進壓瘡修復(fù)中的重要研究方向。