一株大麻脫膠菌株的分離鑒定及其產果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

徐鵬，王大紅，陳亞欣，王澤軒，王子旭，魏來紅，劉高

(河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471023)

大麻(Cannabis sativa)為一年生大麻屬草本植物，其纖維性能優(yōu)異，有吸濕排汗、透氣性好、防紫外輻射、抑制霉菌、防臭等優(yōu)點，是一種應用潛力巨大的環(huán)保型纖維原料[1]。大麻纖維被包埋于莖稈的韌皮部，纖維細胞在胞間層物質的黏結下交織成網狀，并與半纖維素等呈化學健合。大麻纖維與纖維之間、纖絲系統(tǒng)之間和鏈狀分子團系統(tǒng)之間含有大量的膠質，這些膠質中半纖維素含量最高，其次是木質素和果膠，如果用于紡織原料，必須適度去除韌皮部的果膠、半纖維素和木質素等非纖維物質[2]。因此，為合理利用大麻，必須對大麻進行脫膠處理。大麻脫膠的實質是采取各種方法破壞纖維束與周圍組織、韌皮部與表皮、韌皮部與木質部之間的連接。由于大麻纖維過短(7～50 mm)，且纖維整齊度差，若全脫膠會造成短絨而失去可紡性，因此在除去膠質的同時，要減少對纖維細胞間膠質的破壞。脫膠質量的好壞直接影響麻纖維的產量和質量[3]。

大麻脫膠的方式主要有化學法、物理法和生物法?；瘜W法是利用大麻纖維中的膠質和纖維素對燒堿作用的穩(wěn)定性差異去除原麻中的膠質，保留纖維素成分。物理法是利用具有高能量的介質，瞬間釋放能量，打斷大麻纖維的化學鍵，起到脫膠的作用[4]。生物脫膠主要是用微生物或酶去除大麻中果膠等非纖維素物質，主要有冷水漚麻、雨露漚麻和堆積發(fā)酵等脫膠方式[5]。大麻生物脫膠方法與物理和化學脫膠方法相比，具有低能耗、環(huán)保，生產出的纖維質量好等特點，是一種較理想的脫膠方式[6]。目前，大麻生物脫膠所利用的微生物主要為細菌和真菌。一些研究者分離出貝氏芽孢梭菌、嗜果膠芽孢梭菌等厭氧脫膠菌[7]。而好氧脫膠菌主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和微球菌屬。楊田等[8]分離和鑒定2株大麻脫膠菌為枯草芽孢桿菌；Das等[9]用Bacillus sp.和B.pumilus菌聯(lián)合對黃麻進行脫膠，縮短了脫膠時間，并提高了麻纖維的質量。生物脫膠作為一種綠色的麻纖維脫膠方法，是未來大麻脫膠的一種重要方式。目前報道的生物脫膠方法在亞麻、苧麻等工業(yè)化應用中比較成功，但大麻生物脫膠還未工業(yè)化。本文擬從漚麻的水體中篩選具有脫膠功能的細菌，采用生理生化特征與16S rDNA相結合的方法對最優(yōu)菌株進行菌種鑒定，并對其產果膠酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，旨在為大麻微生物脫膠奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大麻由河南省固始縣坤源麻業(yè)有限公司提供；水樣取自河南省固始縣漚麻的水體。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:大麻5 g/L，NH4NO33 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO41 g/L，CaCl20.2 g/L。 大麻的長度為5～6 cm，經過2 g/L的硫酸溶液室溫下浸泡24 h后，沖洗干凈。

分離培養(yǎng)基:果膠 5 g/L，NH4NO33 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，KH2PO41 g/L，CaCl20.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂 20 g/L，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖15 g/L，酵母膏7 g/L，NaCl 0.9 g/L，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，果膠2 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH 7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

采集的水樣置于50℃水浴中處理30 min，取10 mL水樣加入90 mL滅菌后的富集培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)7 d。

1.3.2 初篩和復篩

對富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，取各稀釋度菌懸液0.2 mL分別涂布于分離培養(yǎng)基，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)，至菌落長出。挑取單菌落，反復培養(yǎng)、純化，獲得菌株。每個菌株接入種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)1 d，然后按5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)3 d，測定其果膠酶酶活。

1.3.3 細菌形態(tài)學觀察

細菌接種于LB平板上，培養(yǎng)3 d，觀察細菌的菌落特征和形態(tài)，掃描電鏡觀察菌體細胞特征。

1.3.4 生理生化特征的測定

具體試驗操作見《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。

1.3.5 細菌16S rDNA基因測序以及序列分析

16S rDNA序列 PCR擴增采用細菌通用引物 27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[11]。PCR產物由上海生工生物工程有限公司完成測序。測序后，將該菌株序列在NCBI數(shù)據庫中Blast比對，選擇同源性較高的參比菌株及序列，使用Mega7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 果膠酶酶活的測定

DNS法測定果膠酶活力[12]。0.5 mL 0.25%果膠溶液和0.5 mL稀釋的酶液加入25.0 mL比色管中，然后再加入l mL pH 6.8的磷酸緩沖液，50℃保溫30 min。加入2 mL DNS試劑，煮沸5 min，冷卻定容至20 mL?；靹蚝?40 nm下測定吸光度，根據葡萄糖標準曲線計算出還原糖含量(以半乳糖醛酸計)，以有底物無酶樣品做對照。規(guī)定每小時每毫升酶轉化果膠生成1 ug還原糖(以半乳糖醛酸計)需要酶的量為1個酶活單位(U)。根據葡萄糖和半乳糖醛酸之間的關系，計算發(fā)酵液中果膠酶活力，計算公式如下，其中A代表還原糖含量(mg/mL)。

半乳糖醛酸的量(μg/mL)=A×1000×194/180

酶活(U/mL)=A×1000×194×2/180

1.3.7 碳源、氮源和無機鹽的篩選與優(yōu)化

分別選取葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、L-山梨糖、大豆油、果糖和丙三醇為碳源，選取酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、花生餅粉、玉米漿、硝酸銨、硝酸銨、丙氨酸為氮源，選取磷酸二氫鉀、硝酸鉀、氯化鋅、氯化鈣、硫酸鐵、硫酸鎂、氯化鈉和氯化銅等為無機鹽，考察不同碳源、氮源和無機鹽對產果膠酶的影響，進而選擇最佳碳、氮源和無機鹽進行正交試驗，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成。

1.3.8 菌株的脫膠試驗

稱取50 g原麻，按質量比1∶15的比例加入發(fā)酵后的粗酶液中，50℃下脫膠24 h，然后使用0.2%NaOH、0.2%Na3PO4和0.1%Na2SO3混合液進行化學煮煉。

1.3.9 殘膠率的測定

將質量為G1的大麻放入100 mL濃度為2%的NaOH溶液中，121℃高壓滅菌30 min，而后反復水洗，烘干后稱重記為G2，計算公式為:

殘膠率(%)=[(G1-G2)/G1] ×100%

2 結果與分析

2.1 果膠酶產生菌的分離

通過果膠平板的篩選，從5份水樣分離得到14株細菌，分別編號為X-1、X-2…X-14，從圖1中可以看出14種菌的產果膠酶能力，其中X-6菌的產果膠酶能力最強，達到330 U/mL。

由圖2可知，X-6菌在LB固體培養(yǎng)基中菌落隆起，呈淡黃色，邊緣清楚，表面濕潤、光滑，革蘭氏染色呈陰性。在掃描電鏡下(見圖3)，細胞為短桿狀，大小為0.6～0.8 μm×2～3 μm。

圖1 果膠酶產生菌株的篩選Fig.1 Screening strains producing pectinase

圖2 大麻脫膠菌X-6的菌落形態(tài)Fig.2 The colony form of degumming strain X-6

圖3 X-6菌的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrograph of X-6 strain

2.2 X-6菌的生理生化特征

由表1可知，X-6菌株能利用葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖和麥芽糖等糖，不能利用海藻糖和D-甘露糖，X-6菌株在溫度為15～40℃、pH 6.0～10.0之間均能生長，氧化酶和接觸酶試驗陽性。

表1 X-6菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of X-6 strain

2.3 X-6菌的分子生物學鑒定

16S rDNA基因序列與 GeneBank數(shù)據庫進行BLAST比對，X-6菌株與產堿假單胞菌NR113646.1的16S rDNA基因序列相似性為97%(見圖4)。并根據其形態(tài)、生理生化特征和《伯杰氏細菌鑒定手冊》，該菌株經鑒定并被命名為產堿假單胞菌X-6(Pseudomonas alcaligenes X-6)。

圖4 X-6菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of X-6 strain

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的篩選

2.4.1 碳源篩選

發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，以各碳源(5 g/L)代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。由圖5可知，馬鈴薯淀粉為碳源時果膠酶活力最高，為394 U/mL，說明該菌能夠產生淀粉酶，其次為葡萄糖和玉米淀粉，其為碳源時果膠酶活力分別為362、358 U/mL。因此馬鈴薯淀粉和葡萄糖為其最優(yōu)碳源。

圖5 不同碳源對果膠酶活性的影響Fig.5 Effect of different carbon sources onpectinase activity

2.4.2 氮源篩選

發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，以不同氮源(7 g/L)分別代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母膏。由圖6可知，以玉米漿為氮源的培養(yǎng)基果膠酶產量最高，達422 U/mL，其次是酵母粉，為385 U/mL，因此選定玉米漿和酵母粉為氮源。

圖6 不同氮源對果膠酶活性的影響Fig.6 Effect of differen tnitron sources on pectinase activity

2.4.3 無機鹽篩選

發(fā)酵培養(yǎng)基中其它組分不變，將8種無機鹽分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中代替原培養(yǎng)基中的無機鹽。從圖7可以看出，氯化鈣和氯化鈉對果膠酶的產生有較大的促進作用，分別達到458、432 U/mL，而氯化鋅、硫酸鐵和氯化銅對果膠酶的產生有抑制作用，說明對果膠酶的產生有促進作用的為鈣離子和鈉離子。因此，選用氯化鈣和氯化鈉作為果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽。

圖7 不同的無機鹽對果膠酶活性的影響Fig.7 Effect of different inorganic salt on pectinase activity

2.4.4 正交試驗

培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機鹽經單因子試驗后，考慮到不同因子之間的交互作用，對單因素確定的碳源(馬鈴薯淀粉、葡萄糖)、氮源(玉米漿、酵母粉)、無機鹽(氯化鈣、氯化鈉)進行正交試驗設計(L18(36))，因素水平見表2，結果見表3。

表2 正交設計因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 正交試驗Table 3 Orthogonal experiment

續(xù)表3

從表3中可以看出，6種因素對果膠酶產生的影響順序為:玉米漿＞葡萄糖＞酵母粉＞馬鈴薯淀粉＞氯化鈣＞氯化鈉。最佳培養(yǎng)基配比為A3B2C3D3E3F1，即葡萄糖5 g/L，馬鈴薯淀粉4 g/L，酵母粉4 g/L，玉米漿4 g/L，氯化鈣1.5 g/L，氯化鈉0.5 g/L。經過5次平行驗證實驗，在該條件下果膠酶的平均酶活達到586 U/mL。

2.5 大麻脫膠試驗

根據正交試驗優(yōu)化的培養(yǎng)基組成對X-6菌進行發(fā)酵，發(fā)酵結束后采用發(fā)酵液對大麻進行脫膠試驗，結果見圖8，從圖中可以看出，脫膠后大麻纖維質地均勻，光澤好，顏色較白，殘膠率由38.9%降低至17.2%，果膠去除率較高，脫膠效果較好。

圖8 生物脫膠大麻纖維Fig.8 The hemp fiber after biological degumming

3 討論

大麻脫膠即是將韌皮部的果膠、半纖維素等成分去除，從而釋放大麻纖維，整個脫膠過程應盡量減少破壞纖維細胞，使纖維具有可紡性。傳統(tǒng)的化學脫膠法出麻率低，環(huán)境污染嚴重，麻纖維損傷嚴重[13]。天然水漚麻脫膠時間長，勞動強度比較大，對水體污染嚴重，麻纖維質量不穩(wěn)定。因此，采用微生物脫膠法，分離出具有高果膠酶、半纖維素酶、木質素酶活性及低纖維素酶活性的微生物菌株非常重要。目前分離出的麻類脫膠菌包括梭狀細菌、芽孢桿菌、放線菌、黑曲霉等。目前，微生物脫膠后的精干麻一般仍然含有較多的膠質，無法直接應用于工業(yè)生產，仍需輔以化學方法進一步脫膠[14]。

在本研究中，采用果膠作為唯一碳源的平板，從漚麻的水體中分離到14株具有果膠酶生產能力的細菌，其中X-6菌果膠酶活力達到330 U/mL，通過生理生化特征和16S rDNA序列比對，該菌株被命名為Pseudomonas alcaligenesX-6。通過單因素和正交試驗優(yōu)化該菌的發(fā)酵果膠酶培養(yǎng)基組成，果膠酶活力達到586 U/mL。通過大麻的脫膠試驗，該菌株產生的粗酶液對大麻脫膠效果較好。在大麻生物脫膠過程中，很多因素會影響脫膠效果，如脫膠的溫度、pH、離子的種類和強度等，本研究中只探討了該菌株產果膠酶的能力，而其產半纖維素酶、木質素酶和纖維素酶的能力沒有研究，這些酶同樣是影響微生物脫膠能力的重要指標。王建玲等[15]對堿性果膠酶基因工程菌(pWB980-pel521/WB600)的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，酶活力達到760 U/mL；望瀟文等[16]將工程菌株B.subtilis168在5 L的發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵，果膠酶酶活達到2271 U/mL。與國內報道的其它菌株相比，Pseudomonas alcaligenesX-6菌株的果膠酶活力較低，工業(yè)化應用時，還需進一步提高其產酶能力。因此，下一步的研究主要測定Pseudomonas alcaligenesX-6菌株與脫膠能力有關的其它參數(shù)，并對該菌株進行菌種選育與產酶條件優(yōu)化，提高其產酶性能，為工業(yè)化應用提供基礎。