苧麻耐鎘種質快速篩選方法研究

陳坤梅，熊和平，朱愛國，陳平，陳繼康，高鋼，喻春明

(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南長沙410205)

土壤鎘污染不僅對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，同時也會給人體健康帶來風險，加強農(nóng)田鎘污染防治研究具有重要的現(xiàn)實意義。植物修復被認為是友好、經(jīng)濟、環(huán)保的方法，故在重金屬污染土壤修復中頗受青睞[1-2]。然而，目前所發(fā)現(xiàn)的重金屬超富集植物大多生長緩慢、生物量低，在惡劣環(huán)境下如重金屬重度污染土壤上生長受阻，大大影響修復效果[3]。

苧麻又稱中國草，是我國古老的天然纖維作物。苧麻對鎘具有高耐、高吸收特性，且具備適應能力強、生長迅速、繁殖能力強、生物產(chǎn)量大等優(yōu)點，彌補了現(xiàn)有超積累植物植株矮小、生長速度慢、受氣候影響大、很難實現(xiàn)實際應用價值等不足，具有很好的生態(tài)效益[4-5]。苧麻是多年生作物，可免去連年栽種的工序，節(jié)約修復成本。此外，苧麻的傳統(tǒng)用途是作纖維用，其產(chǎn)品不進入食物鏈，對人類健康不存在安全隱患。因此，苧麻是修復鎘污染土壤的理想植物[6-7]。

當前，利用苧麻修復重金屬污染土壤的研究大多集中在耐鎘品種篩選[8-9]及鎘脅迫下苧麻植株生理生化的變化[10-11]等方面，在品種選育方面的研究滯后。苧麻品種選育主要環(huán)節(jié)是:根據(jù)育種目標選擇雙親、人工雜交、F1代單株選擇(無性繁殖擴繁F1代單株、調查所選單株的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)并結合特定育種目標的性狀調查)、小區(qū)試驗、擴大范圍區(qū)試試驗等[12-13]。由于苧麻結實率高(每個單株所結種子量可達數(shù)萬甚至更多)，種子較小(千粒重約0.05 g)，將所有雜交F1代種子在地里繁殖，并從數(shù)萬的種子苗中擇優(yōu)選擇，該工序工作量大，選擇效率低。因此，在苧麻品種選育中，有必要研究一種或幾種快速篩選苧麻種子苗的方法以輔助苧麻品種選育，加速育種進程。苧麻植株對鎘的耐受能力是苧麻鎘高富集新品種選育所要考察的重要指標，因此，在幼苗期采用適當?shù)姆椒▽ζr麻雜交種子苗的耐鎘能力進行快速篩選，可加速苧麻鎘高富集新品種選育進程。

本研究擬選擇3種培養(yǎng)基質，設計不同的鎘脅迫濃度，研究苧麻種子苗對鎘的耐受能力，比較不同篩選方法的優(yōu)缺點，綜合評價選出適宜的篩選方法，以期為苧麻鎘高富集新品種選育前期單株輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中飼苧1號種子為中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所育成的品種，本研究所用種子為2017年收獲。種子收獲后晾曬干燥，剝?nèi)ネ鈿溆?。苧麻是雜合體，又是常異交作物，即使是同一品種所結的種子也會出現(xiàn)一定程度的性狀分離，因此本文所用的中飼苧1號種子可作為F1代種子開展耐鎘篩選試驗。

1.2 試驗設計及鎘脅迫處理方法

組培篩選試驗:選取成熟飽滿的苧麻種子，在超凈工作臺內(nèi)，先用70%的乙醇浸泡消毒1 min，無菌水沖洗3～4次后，置于0.1%的升汞中浸泡消毒7 min，再用無菌水沖洗3～4次，用濾紙吸干水分，均勻接種于MS(內(nèi)含0.1 mg/L的NAA)培養(yǎng)基上。室溫下用黑布遮光暗處理4 d，然后置于溫度25℃，濕度60%～90%，光照強度100～200 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h/12 h的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。光照培養(yǎng)16 d后轉接至鎘濃度分別為0、2.5、5、10、15 mg/L的培養(yǎng)基中，每個濃度接種4瓶，每瓶2株。期間觀察記錄種子苗的生長情況、統(tǒng)計死亡率。

水培篩選試驗:該試驗在培養(yǎng)皿中進行，先是在培養(yǎng)皿內(nèi)放一層棉花，棉花上面鋪設兩層濾紙，每個培養(yǎng)皿用等量的鎘溶液潤濕(對照用去離子水代替)。苧麻種子去掉外殼后均勻散播于培養(yǎng)皿中，每皿播100粒種子，于溫室下培養(yǎng)。每天觀察記錄表型，統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)并測定主根長。根據(jù)濾紙的干燥程度，用移液槍向每個培養(yǎng)皿中加入等量對應濃度的鎘溶液(對照用去離子水代替)，保持濾紙一直呈濕潤狀態(tài)。預試驗中，鎘濃度設置為0、10、50、100、150、200 mg/L；正式試驗鎘濃度調整為0、5、10、20、50、100 mg/L。 處理期間統(tǒng)計種子苗的發(fā)芽率，測定根長。

土培篩選試驗:該試驗用蛭石培養(yǎng)苧麻種子苗，蛭石稱重后放入育苗盤(缽，長、寬、高分別為7、7、8 cm)，育苗盤下墊一托盤，自育苗盤底部加水，待蛭石完全吸水潤濕后將中飼苧1號種子均勻散播于每個育苗盤中，蓋上保鮮膜，置于溫室下培養(yǎng)，5～7 d后種子萌發(fā)，萌發(fā)3 d后揭開保鮮膜。自種子播種算起13 d后用鎘處理，先將鎘溶解于水，鎘溶液加至托盤內(nèi)，自育苗盤底部吸入鎘溶液。該試驗設置了預試驗(起始鎘濃度為40 mg/kg，后調整為120 mg/kg)、二次試驗(鎘濃度分別為 0、40、80、120、160、200、400 mg/kg)和三次試驗(鎘濃度分別為 0、500、1000、2000、4000、8000 mg/kg)。處理期間記錄種子苗表型變化。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用excel計算處理，用SPSS 19.0進行顯著性分析，采用LSD比較處理和對照的差異性，采用Sigma 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 組培試驗篩選結果

由圖1可知，鎘脅迫15 d后，苧麻組培種子苗的生長受到抑制，鎘脅迫濃度越高抑制程度越大，表現(xiàn)為麻苗植株矮小，根系少而短；鎘脅迫21 d后，處理濃度≤5 mg/L的麻苗仍能生長，但葉片失綠，當鎘濃度≥10 mg/L時，麻苗生長受到嚴重抑制，葉片失綠嚴重，尤其是在高濃度(15 mg/L)處理下，麻苗葉片出現(xiàn)白化的現(xiàn)象，植株幾近死亡。

圖1 鎘脅迫對苧麻組培種子苗的影響Fig.1 Effect of ramie seedling under cadmium treatment

2.2 水培試驗篩選結果

首先設置了≤200 mg/L的鎘濃度梯度進行預試驗，發(fā)現(xiàn)種子點播4 d后，對照組中大部分種子(大于80%)能萌發(fā)并生根，葉片綠色；10 mg/L濃度處理的種子約50%能萌發(fā)并生根，但葉片略黃；50 mg/L濃度處理的種子約有30%能萌發(fā)；100 mg/L濃度處理的種子僅10%露出白芽；鎘濃度≥150 mg/L處理的種子未見萌發(fā)趨勢(見圖2A)。據(jù)此，重新設置了≤100 mg/L的鎘濃度開展后續(xù)試驗，結果發(fā)現(xiàn)低鎘濃度(≤5 mg/L)處理下苧麻種子發(fā)芽率與對照相當，說明低鎘濃度脅迫對苧麻種子發(fā)芽率影響不大；鎘濃度≥10 mg/L時，嚴重影響苧麻種子發(fā)芽率，濃度越高發(fā)芽率越低；在50 mg/L濃度下處理13 d后，其發(fā)芽率較之處理7 d的發(fā)芽率有所降低，說明部分種子苗在鎘脅迫下死亡；在高濃度(100 mg/L)下，種苗在處理13 d后全部死亡(見圖2B、3A)。另外，鎘脅迫顯著影響苧麻種子苗根系的發(fā)育，隨著脅迫濃度的增加，根長逐漸變短(見圖3B、4)。

2.3 土培試驗篩選結果

預試驗發(fā)現(xiàn)，120 mg/kg的鎘濃度處理下，苧麻種子苗葉片發(fā)黃，但仍能生長，未能達到篩選的目的(見圖5)。調整鎘脅迫濃度開展二次試驗，結果發(fā)現(xiàn)，鎘濃度增至400 mg/kg后，苧麻種子苗長勢雖比對照弱小，但并未致死，仍未達到篩選的目的(見圖6)。繼續(xù)調整鎘脅迫濃度開展三次試驗，結果發(fā)現(xiàn)，隨著處理濃度的增加，苧麻種子苗生長逐漸變?nèi)?，高濃?≥4000 mg/kg)處理下麻苗葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀，尤其在8000 mg/kg濃度處理下，大部分麻苗死亡，存活的少量麻苗即認為是耐鎘能力強的種苗(見圖7)。

圖2 鎘脅迫對苧麻種子萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of germination in ramie seeds under cadmium treatment

圖3 鎘脅迫下苧麻種子發(fā)芽率(A)及種子苗根長(B)Fig.3 Germination rate of ramie seeds(A)and root length of ramie seedlings(B)under cadmium treatment

圖4 鎘脅迫13 d后苧麻種子苗Fig.4 Ramie seedlings under cadmium treatment for 13 days

圖5 土培苗耐鎘篩選預試驗Fig.5 Pre-screening experiment for cadmium tolerant seedlings of ramie in soil

圖6 土培苗耐鎘篩選二次試驗Fig.6 Secondary screening experiment for cadmium tolerant seedlings of ramie in soil

3 討論

種苗篩選是苧麻育種過程中的重要一環(huán)。以往對苧麻雜交F1代種子的篩選多在田間進行，一般2月份左右播種，1個多月后麻苗出土，經(jīng)過1～2個月煉苗期，可根據(jù)育種目標鑒定、移栽。該方法周期長，人工成本高，并且受自然條件影響較大。苧麻種苗耐鎘篩選尚未有先例可循，尋找可用于種苗快速簡便的篩選方法，可極大地加速苧麻耐鎘品種選育進程。

通過組培篩選，較低的鎘濃度處理麻苗即出現(xiàn)較明顯表型，達到篩選的目的。但是，組培的方法對操作的技術要求較高，每個環(huán)節(jié)(如培養(yǎng)基配制、種子消毒處理、接種、麻苗轉接等環(huán)節(jié))的處理需專業(yè)的技術人員來完成，并且如果需要大量的種子篩選，組培工作量較大，成本也相應增加。另外，組培篩選從接種到表型鑒定至少需40 d，時間較長，因此，該方法不適用于大量種苗篩選。

圖7 土培苗耐鎘篩選三次試驗Fig.7 Third screening experiment for cadmium tolerant seedlings of ramie in soil

水培的方式常被用于多種作物如玉米[14]、小麥[15]、水稻[16]耐鎘種苗的篩選，該方法簡便易行，可快速鑒別所篩選作物種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種苗根長等指標。本研究水培篩選試驗中，50 mg/L鎘濃度處理的種子苗，在處理13 d后部分苗死亡，存活的麻苗即認為是鎘高耐的種苗，但其根系較短(＜1 cm)，移栽至土里不易存活；而20 mg/L鎘濃度處理的種子，其存活的麻苗根系在1～2 cm之間，移栽至土中比用50 mg/L鎘濃度處理的種子苗易于存活。因此，若用水培的方法篩選耐鎘苧麻種子苗，建議用20 mg/L鎘的濃度。水培篩選的方法簡單易行、成本低，處理7～13 d就可鑒定表型，達到篩選的目的。

采用土培篩選，自種子點播起30 d內(nèi)便出現(xiàn)明顯表型，達到篩選目的。該方法快速、簡便，由于本就在固體介質中篩選，篩選出的種苗再移栽至土壤中也易于存活。但該方法篩選所用的鎘濃度較高，實施時應注意采取措施避免鎘對周圍環(huán)境的污染。

4 結論

組培、水培和土培這三種方法篩選鎘高耐性苧麻種子苗各有利弊?？紤]到篩選的時效和成本，以水培和土培篩選為佳，其中，土培篩選法其種苗移栽更易存活，有利于后續(xù)的繁種環(huán)節(jié)。因此，本研究認為通過土培的方式可快速有效篩選出鎘高耐性的苧麻種子苗。