不同苧麻品種根際微生物多樣性群落結構分析

蘇小惠，白玉超，3#，佘瑋，2，楊瑞芳，2，崔丹丹，李林林，王繼龍，崔國賢，2*

(1.湖南農業(yè)大學苧麻研究所，湖南 長沙410128；2.湖南農業(yè)大學農學院，湖南長沙410128；3.深圳市芭田生態(tài)工程股份有限公司，廣東深圳518105)

苧麻(Boehmeria niveaL.)屬蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)，是一種多年生宿根性草本纖維植物[1]。苧麻地下部分俗稱“麻蔸”，包括根系和地下莖。在土壤中，根系分泌物和根際微生物間的相互作用是十分重要的過程，植物根系通過分泌各種次生代謝物質對根際微生物的種類、數量和分布產生影響，對根際微生物群落結構有選擇塑造作用[2]。Eisenhauer等[3]的研究表明，根系分泌物介導下的植物-微生物互作關系變化對于土壤肥力、健康狀況以及植物生長發(fā)育有著極其重要的作用。Berendsen等[4]認為，根際是植物體的一個組成部分，根際微生物群落的宏基因組是植物體的第二基因組。吳林坤等[2]認為，植物的他感作用、連作障礙、連作促進或是間套作增產等，均是由其根系分泌物介導下的植物與特異微生物共同作用的結果。Gschwendtner等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同的馬鈴薯品種之間根際微生物群落差異很大，而且在不同生長發(fā)育時期，馬鈴薯根際微生物群落結構也發(fā)生變化，這可能都與根系分泌物的組成和數量有關。擬南芥根系分泌物的組分與含量隨生長發(fā)育時期不同而顯著變化，其根部相關基因的表達水平也相應變化，且其根際微生物功能基因的表達模式與擬南芥不同生長發(fā)育時期的根系分泌物分泌模式顯著相關[6]。植物根系分泌物的產生是植物根部長期進化的結果，是適應環(huán)境的一種體現(xiàn)。本研究擬以湘苧3號、多倍體1號、中苧1號、湘苧7號和R057的土壤樣本基因組DNA為模板進行PCR擴增，并采用高通量測序方法初步探討苧麻根際微生物多樣性的特點，旨在為進一步探索根系分泌物介導下苧麻-土壤-微生物的互作關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用苧麻種植于湖南省瀏陽市澄潭江鎮(zhèn)“苧麻高產創(chuàng)建與高效施肥研究與示范基地”(北緯27°59′，東經113°46′)，試驗品種為湘苧3號、多倍體1號、中苧1號、湘苧7號和R057。 于2011年5月嫩梢扦插育苗，同年6月移栽，株距45 cm，栽培密度3.3×104株/公頃，同年8月破稈。2015年為5齡麻。土壤基本理化性質如表1所示。

表1 土壤基本理化性質Table 1 Physicochemical properties of experiment soils

1.2 取樣方法

于2015年8月采用剝落法收集湘苧3號、多倍體1號、中苧1號、湘苧7號和R057 5個苧麻品種的根際土壤。首先選取生長正常的植株，整蔸取出，抖落較松散的土壤，然后收集附著在根上0～4 mm間的土壤作為根際土[7]。將土壤樣品去除動植物殘體等雜質，裝入密封袋中，立即置于液氮中運回實驗室，置于-80℃冰箱中，備用。由于研究經費有限，本研究測序未設置生物學重復。

1.3 基因組DNA的提取

采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)對土壤樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.4 PCR擴增

a.模板:稀釋后的基因組DNA；

b.引物:根據測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，引物設計如表2所示；

c.PCR 采用 rTaq DNA Polymerase，20 μL 反應體系:10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μmol/L)0.8 μL，Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，補足 ddH2O 至 50 μL。 PCR 儀，ABI GeneAmp?9700 型。 16S rDNAPCR 擴增條件:1×(3 minutes at 95 °C)；27×(30 seconds at 95 °C；30 seconds at 55 °C；45 seconds at72 °C)；10 minutes at 72 °C，10 °C until halted by user。 18S rDNA-PCR 擴增條件:1×(3 minutes at 95 °C)；35×(30 seconds at 95 °C；30 seconds at 55 °C；45 seconds at 72 °C)；10 minutes at 72 °C，10°Cuntil halted by user。PCR產物采用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫。

表2 PCR引物設計Table 2 PCR primer design

1.5 熒光定量

參照電泳初步定量結果，將PCR產物用Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.6 Miseq文庫構建和測序

Miseq文庫構建和測序在美吉生物(上海)科技有限公司進行，測序平臺為 Illumina MiSeqPE300/PE250。

1.7 生物信息分析

測序結束后，對有效序列進行去雜、修剪、去除嵌合體等過濾處理，得到優(yōu)化序列。根據序列97%的相似性形成操作分類單元OTU(Operational Taxonomic Units)，對OTU的代表序列作分類學分析?；贠TU聚類分析結果，對OTU進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 苧麻根際土壤細菌群落多樣性分析

2.1.1 優(yōu)化序列數據統(tǒng)計

湘苧3號、多倍體1號、中苧1號、湘苧7號和R057 5個品種土壤樣本中共得到180975個有效序列，總堿基數為79248780，平均序列長度為437.86 bp。各樣本優(yōu)化序列數據統(tǒng)計如表3所示。

表3 各樣品優(yōu)化序列數據統(tǒng)計Table 3 Data statistics of each sample optimal sequence

2.1.2 苧麻根際土壤細菌群落多樣性指數

在97%相似水平上土壤樣品細菌群落多樣性指數如表4所示。5個苧麻品種根際土壤樣品的生物分類單元OTUs為754～950。Coverage(覆蓋率)是測序深度指數，其數值越高則表示樣本中序列被測出的概率越高，5個苧麻品種根際土壤樣品的覆蓋率均在99%以上，表明絕大部分的細菌種群都被檢測出來。Ace指數和Chao1指數是用來估算菌群豐度(Community richness)的指數，5個苧麻品種根際土壤樣品的Ace指數為817～999，Chao1指數為873～1012。Shannon指數和Simpson指數是用來估算菌群多樣性(Community diversity)的指數，Shannon值越大，說明群落多樣性越高，Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低[10]。5個苧麻品種根際土壤樣品的Shannon指數為5.39～5.94，Simpson指數為0.0049～0.0106。其中湘苧7號Shannon指數(5.39)低于其他4個樣品，而Simpson指數(0.0106)高于其他樣品并顯著高于湘苧3號，說明湘苧7號品種細菌群落多樣性較其他品種為最低，湘苧3號品種細菌群落多樣性較其他品種為最高。

表4 細菌群落多樣性指數Table 4 Bacterial community diversity indices

2.1.3 苧麻根際土壤細菌群落結構組成分析

苧麻根際土壤樣品細菌群落結構在門水平上的組成和豐度如圖1所示。5個苧麻品種根際土壤樣品OTU與16S細菌和古菌核糖體數據庫(Silva、RDP、Greengene)比對[11-13]，歸屬于24門，52綱，125目，213科，329屬，569種。主要的門有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等。其中，變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門占主導地位，約占細菌總數的88.92%～97.45%。不同苧麻品種根際土壤中以Proteobacteria在細菌中所占比例最高，品種間變化范圍35.57%～50.08%；其次為Acidobacteria，品種間變化范圍17.53%～33.27%。

圖1 土壤細菌群落門分類水平相對豐度Fig.1 Relative abundance of soil bacterium on the level of phylum

2.2 苧麻根際土壤真菌群落多樣性分析

2.2.1 優(yōu)化序列數據統(tǒng)計

湘苧3號、多倍體1號、中苧1號、湘苧7號和R057 5個品種土壤樣本中共得到143599個有效序列，總堿基數為59622314，平均序列長度為400.98 bp。各樣本優(yōu)化序列數據統(tǒng)計如表5所示。

2.2.2 苧麻根際土壤真菌群落多樣性指數

在97%相似水平上土壤樣品真菌群落多樣性指數如表6所示。5個苧麻品種根際土壤樣品的生物分類單元OTUs為190～220。5個苧麻品種根際土壤樣品的覆蓋率均在99%以上，表明絕大部分的真菌種群都被檢測出來。5個苧麻品種根際土壤樣品的Ace指數為200～232，Chao1指數為202～235，Shannon指數為2.63～3.43，Simpson指數為0.0671～0.2360。 其中湘苧3號的Shannon指數在5個苧麻品種根際土壤樣品中最低，而Simpson指數顯著高于其他樣品。

表5 各樣品優(yōu)化序列數據統(tǒng)計Table 5 Data statistics of each sample optimal sequence

表6 真菌群落多樣性指數Table 6 Fungus community diversity indices

2.2.3 苧麻根際土壤真菌群落結構組成分析

苧麻根際土壤樣品真菌群落結構在門水平上的組成和豐度如圖2所示。5個苧麻品種根際土壤樣品OTU與ITS真菌數據庫(Unite)比對[14]，歸屬于43門，67綱，87目，102科，120屬，174種。主要的門有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、纖毛亞門(Ciliophora)、壺菌門(Chytridiomycota)等，此外還檢測到有 Eukaryota_unclassified、Fungi_unclassified、扁形動物門(Platyhelminthes)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)、褐藻門(Ochrophyta)等。其中，以子囊菌門(Ascomycota)占據主導地位，占真菌總數的45.51%～68.96%；接合菌門(Zygomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)次之，分別占真菌總數的5.29%～15.81%和2.74%～20.13%。在5個苧麻品種中，湘苧3號根際土壤子囊菌門豐度最高(68.96%)，但接合菌門豐度最低(5.29%)；多倍體1號根際土壤子囊菌門豐度最低(45.51%)，但接合菌門豐度最高(15.81%)。

圖2 土壤真菌群落門分類水平相對豐度Fig.2 Relative abundance of soil fungus on the level of phylum

2.3 苧麻根際土壤真菌與細菌數量比值

苧麻根際土壤真菌與細菌數量比值通過樣品真菌OTUs數量與細菌OTUs數量比值來計算。有學者認為，真菌型土壤是地力衰竭的標志，細菌型土壤是土壤肥力提高的一個生物指標[15]。不同苧麻品種根際土壤真菌與細菌數量比如圖3所示。由圖3可知，R057、多倍體1號、湘苧3號、湘苧7號和中苧1號根際土壤真菌與細菌數量比為0.23～0.29，其中以中苧1號根際土壤中真菌與細菌數量比最高。

圖3 土壤真菌與細菌數量比值Fig.3 Soil fungi and bacteria quantity proportion

3 討論與結論

高通量測序具有成本低、通量高等優(yōu)點，在微生物生態(tài)學研究中得到了廣泛應用。本文通過Miseq測序平臺研究了苧麻根際土壤細菌和真菌的群落結構組成，以期為后續(xù)苧麻化感效應研究奠定基礎。在本研究中，5個苧麻品種根際土壤樣品細菌和真菌的覆蓋率均在99%以上，表明絕大部分的細菌和真菌種群都被檢測出來，其中檢測到的主要細菌門有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等，真菌門主要有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、纖毛亞門(Ciliophora)、壺菌門(Chytridiomycota)等。在本研究中細菌中以變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢門，真菌中子囊菌門、接合菌門和擔子菌門為優(yōu)勢門。變形菌門在擬南芥、玉米、枸杞等根際中均有富集分布，可見變形細菌能夠適應多種植物根際微環(huán)境[16-18]。酸桿菌門能夠降解復雜的木質素和纖維素，殘留的苧麻植株經過酸桿菌門的分解能夠為土壤微生物提供充足的能源，并為土壤提供養(yǎng)分[19-21]。子囊菌和擔子菌是土壤中重要的分解者，子囊菌門大多數為腐生菌，可以分解木質素、角質素等難降解的有機質，在養(yǎng)分循環(huán)中擔任著重要角色[22-24]。在本研究中，不同苧麻品種間微生物多樣性存在一定差異，且真菌的多樣性遠低于細菌。朱四元等[25]研究表明，不同苧麻品種間根際微生物數量存在顯著差異，且細菌微生物量大于真菌；周建霞等[26]發(fā)現(xiàn)苧麻土壤微生物中細菌數量在品種間存在顯著差異；方敏等[27]研究表明，馬纓杜鵑根系微生物分布于41個細菌門和6個真菌門，且根系不同生態(tài)位之間微生物群落結構存在差異。

在植物生長發(fā)育過程中，根系分泌物影響著土壤中養(yǎng)分的有效性、重金屬的吸收和轉運、根際土壤的理化性質以及根際微生物種群的結構[28]。在作物種植生產中，一些作物的根系分泌物能夠刺激某些有害根際微生物的生長和繁殖，這些有害微生物對下茬同一作物的生長會產生抑制作用，造成連作障礙[29]。植物分泌的化感物質和根際微生物之間的相互作用是一個重要過程，植物根系分泌的各種次生代謝產物對根際微生物的種類、數量和分布產生影響[30]。白玉超等[31-32]以甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯和正己烷為浸提劑，用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)對苧麻根際分泌物進行了組分分析，主要鑒定出2，4-二叔丁基苯酚、棕櫚酸、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、十八碳酸甲酯等物質。酚酸類物質是一種重要的化感物質，能抑制微生物產生氣體與揮發(fā)性脂肪酸的作用，并能減少微生物對其生長介質的消耗，同時，微生物的分布類群與土壤中酚酸的種類和濃度也存在一定的關系[33-34]。有研究[35]指出，隨著大棚番茄連作年限的增加，番茄根分泌的酚酸類物質增加了土壤中有害真菌的數量。苧麻作為多年生作物，其根系分泌物與根際微生物多樣性的關系尚不明確。苧麻根際土壤中積累的化學物質可能直接影響根系生長或通過影響土壤微生物群落結構而改變土壤環(huán)境，進而影響苧麻的生長，這可能是探索苧麻敗蔸機理研究中的一個重要方向。