微生物實(shí)驗(yàn)室常用菌種保存方法及臨床意義的探討

彭敏飛 李潔 賀燕婷 次仁央中 裘淼偉 周芳美*

菌種保存是維持微生物菌種生物特性、活性與遺傳特性的技術(shù)［1］，基本原理是使菌種的生命活動(dòng)對(duì)能量需求最小，將微生物的代謝限制在最小范圍［2］，且菌種在保存的過程中易受到雜菌的污染、基因突變甚至死亡。菌種保存方法多樣，最理想的方式為真空冷凍干燥法［3］，但需要特殊設(shè)備，技術(shù)難度大且較昂貴，一般單位難以實(shí)現(xiàn)［2，4］。但在日常工作、質(zhì)控、比對(duì)、教學(xué)過程中均離不開對(duì)菌種的需要［5］，且保存菌種時(shí)要針對(duì)不同的菌種保存的時(shí)間選用不同的保存方法［6］，為了探究微生物實(shí)驗(yàn)室常用菌種的適宜保存方法，為臨床提供準(zhǔn)確可靠的檢驗(yàn)結(jié)果。本研究對(duì)6種常用的保存方法進(jìn)行比較，以期為微生物實(shí)驗(yàn)室菌種保存方法的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與檢疫實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心保存。主要有5類：（1）腸桿菌：變形桿菌、大腸埃希菌、痢疾桿菌、甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、傷寒桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌、摩根摩根菌；（2）葡萄球菌：金黃色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌；（3）鏈球菌：甲型溶血型鏈球菌、乙型溶血型鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌；（4）不發(fā)酵革蘭陰性桿菌：銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、黃桿菌；（5）真菌：白假絲酵母菌、新生隱球菌、近平滑假絲酵母菌。

1.2 試劑 綿羊血；瓊脂粉；液體石蠟；甘油；牛肉浸膏；蛋白胨；血瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基，脫脂牛奶，甘油肉湯，液體石蠟，均用常規(guī)方法配制，滅菌。

1.3 方法 （1）菌種保存方法：22種菌種每種保存方法各保存40份，其中脫脂牛奶低溫凍存法、甘油肉湯法、液體石蠟法3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月復(fù)蘇菌種，觀察復(fù)蘇情況和生化特征。血瓊脂培養(yǎng)基低溫保存法、固體培養(yǎng)基低溫保存法、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基低溫保存法，1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月復(fù)蘇菌種，觀察復(fù)蘇情況和生化特征。（1）脫脂牛奶低溫凍存法：將新鮮牛奶反復(fù)煮沸冷卻脫脂，分裝于無菌凍存管中［7］，每管1.5ml，挑取純化后的新鮮菌苔2環(huán)于凍存管中，-80℃保存。（2）甘油肉湯法：用無菌涂布棒將需要保存的新鮮菌洗脫在甘油肉湯中，制成菌懸液，移入1.5ml凍存管中，-80℃保存。（3）液體石蠟法：將液體石蠟進(jìn)行高壓滅菌之后，將所要保存的細(xì)菌菌落用接種環(huán)接種到斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，將無菌液體石蠟加入斜面培養(yǎng)基，高出培養(yǎng)基1cm進(jìn)行封口，置4℃冰箱保存。（4）血瓊脂培養(yǎng)基低溫保存法：將所要保存的細(xì)菌四區(qū)劃線接種到配制好的血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，放入4℃冰箱保存。（5）固體培養(yǎng)基低溫保存法：將所要保存的菌種四區(qū)劃線接種到固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，放入4℃冰箱保存。（6）營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基低溫保存法：將所要保存的菌種用接種針接種在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，放入4℃冰箱保存。（2）細(xì)菌的生理生化反應(yīng)鑒別：本實(shí)驗(yàn)在菌種復(fù)蘇后對(duì)菌種進(jìn)行了菌種鑒定。菌種經(jīng)過分離純化之后，觀察菌落形態(tài)，通過菌落形態(tài)來確定菌種是否發(fā)生污染與變異［8］。同時(shí)進(jìn)行了各種生化反應(yīng)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 血瓊脂低溫保存法、固體培養(yǎng)基低溫保存法、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基低溫保存法 3種方法第4個(gè)月細(xì)菌存活率下降至＜50%，甚至降為0%，適合菌種短期內(nèi)保存。血瓊脂低溫保存法腸桿菌、葡萄球菌、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌、鏈球菌第4個(gè)月的存活率分別為50%、40%、40%、20%；固體培養(yǎng)基低溫保存法、營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基低溫保存法腸桿菌腸桿菌、葡萄球菌、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌4個(gè)月的存活率分別為 10%、20%、0%。具體結(jié)果見表1。

2.2 脫脂牛奶低溫凍存法、甘油肉湯法、液體石蠟法 菌種在脫脂牛奶低溫凍存下，18個(gè)月后菌種存活率為100%。且菌株生長良好，菌落形態(tài)正常，適合菌種超長期保存；甘油肉湯法、液體石蠟法兩種保存方法6個(gè)月內(nèi)菌種存活率均＞70%，適合菌種長期保存。甘油肉湯法：腸桿菌、葡萄球菌、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌、鏈球菌、真菌6個(gè)月的存活率分別為 90%、80%、80%、80%、70%；液體石蠟法腸桿菌、葡萄球菌、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌6個(gè)月的存活率分別為90%、80%、90%。結(jié)果見表2。

表1 不同保存方法菌種存活率（%）

表2 不同保存方法菌種存活率（%）

3 討論

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室是一個(gè)專業(yè)性很強(qiáng)的特殊實(shí)驗(yàn)室，為感染性疾病的診斷、抗生素的合理應(yīng)用及院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)與防控提供重要的依據(jù)。而微生物實(shí)驗(yàn)室在標(biāo)本檢測(cè)之前，培養(yǎng)基的生長試驗(yàn)、染色液和手工生化反應(yīng)的質(zhì)控、細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、質(zhì)譜儀的性能驗(yàn)證等都需要質(zhì)控菌種進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)在控后，方可進(jìn)行檢測(cè)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，及時(shí)發(fā)送報(bào)告至臨床科室。質(zhì)控菌種及部分臨床菌種是作為實(shí)驗(yàn)室常用菌種，且購買成本昂貴，根據(jù)質(zhì)控頻度（每日、每周、每月、年校準(zhǔn)）需要選擇不同的方法進(jìn)行保存，常用菌種是否存活是關(guān)系臨床微生物實(shí)驗(yàn)室日常工作是否正常開展的關(guān)鍵。

保存菌種不僅要求菌種存活，還要求其生物學(xué)性狀、生理特性、抗原性等方面不發(fā)生變異，這是保存菌種的重要環(huán)節(jié)［9］。菌種保存方法多種多樣，在應(yīng)用過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室不同菌種保藏目的，選取恰當(dāng)?shù)姆椒ǎ?0］。

本實(shí)驗(yàn)中比較了三種低溫保存法保存菌種，隨著保存時(shí)間的延長，每種保存方法下的菌種存活率都有所下降。鏈球菌保存選用血瓊脂培養(yǎng)基低溫保存法較好，菌種存活率更高，但容易發(fā)生污染，肺炎鏈球菌保存在血瓊脂培養(yǎng)基上則需要2～4d傳代一次；斜面培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基低溫保存法操作步驟較簡(jiǎn)便，適合腸桿菌、葡萄球菌和非發(fā)酵革蘭陰性桿菌短期內(nèi)保存。血瓊脂培養(yǎng)基低溫保存法、固體培養(yǎng)基低溫保存法和營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基低溫保存法適合一般菌種短期內(nèi)保存，可以隨時(shí)傳代，操作方便，不需要其他設(shè)備。但是需要頻繁傳代，以確保菌種的存活情況，菌種變異的幾率較大，而且容易受到污染［11］。液體石蠟法的優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)考慮了低溫和阻斷氧氣，從兩個(gè)方面降低了培養(yǎng)菌種的活性，能夠延長菌種的保存時(shí)間［12］；甘油肉湯法和液體石蠟法保存菌種相對(duì)較好，保存時(shí)間長，而且不用頻繁傳代，易于保持細(xì)菌的生理生化特性，受污染的機(jī)會(huì)也較?。?3］。甘油肉湯法前期準(zhǔn)備工作較繁瑣，液體石蠟法操作簡(jiǎn)便。脫脂牛奶保存菌種時(shí)，雖然前期脫脂牛奶制備工作較繁瑣。但菌種保存的時(shí)間較長，易于保持菌種的生理生化特性，不容易發(fā)生變異，受污染的機(jī)會(huì)?。?4］；為開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研工作使用菌種提供了方便［15］。適合營養(yǎng)要求高且需超長期保存的菌種，如鏈球菌等。

本實(shí)驗(yàn)通過6種菌種保存方法對(duì)22種菌種進(jìn)行保存比較，6種保存方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。為微生物實(shí)驗(yàn)室選用適宜菌種保存方法提供依據(jù)。