以黃連素/羥丙基-β-環(huán)糊精為熒光探針檢測(cè)金剛烷胺

許 巖 賀永桓 鄭舒文 劉宇寧 陳衛(wèi)華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

β-環(huán)糊精含有7個(gè)葡萄糖單元，各個(gè)單元通過(guò) α-1,4 糖苷鍵相互連接，形成一個(gè)圓錐狀化合物，具有 “內(nèi)疏水外親水”的結(jié)構(gòu)特性[1-2]。而羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)是在β-環(huán)糊精的C-2、C-3或者C-6位的羥基上引入羥丙基形成的化合物，該基團(tuán)的引入導(dǎo)致分子內(nèi)的氫鍵被打開(kāi)，使得β-環(huán)糊精內(nèi)部的規(guī)則性結(jié)構(gòu)逐漸分散成多組分的結(jié)構(gòu)混亂的化合物，從而有效提高HP-β-CD的溶解度[3-5]。由于HP-β-CD在水中具有較好的溶解性，因此在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

金剛烷胺(amantadine，AMD)是一種用于人類(lèi)流感治療，抵抗病毒入侵的藥物[6]。研究表明，金剛烷胺類(lèi)藥物可用于畜禽流感的預(yù)防和早期治療，且具有良好的治療效果[7]。但長(zhǎng)期過(guò)量使用金剛烷胺類(lèi)藥物會(huì)使畜禽類(lèi)產(chǎn)生中毒癥狀，影響動(dòng)物肉質(zhì)品質(zhì)，通過(guò)食物鏈也會(huì)危害人類(lèi)健康[8]。因此，農(nóng)業(yè)部規(guī)定禁止將金剛烷胺類(lèi)藥物用于動(dòng)物疫病防治，但仍存在著在獸藥制劑中非法添加金剛烷胺的現(xiàn)象，給動(dòng)物源食品安全問(wèn)題及人類(lèi)健康造成了極大威脅。目前，金剛烷胺的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫試劑盒、電化學(xué)法等[9-11]，上述檢測(cè)方法靈敏度高、檢測(cè)性好，但價(jià)格昂貴。此外，上述方法在前期處理時(shí)需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，處理過(guò)程繁瑣，只適用于小范圍內(nèi)的檢測(cè)。而熒光分光光度法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于藥物的測(cè)定。但金剛烷胺的水溶液沒(méi)有熒光，采用常規(guī)的熒光分光光度法不能直接測(cè)定，故若想采用熒光分光光度法測(cè)定金剛烷胺，可基于主客體競(jìng)爭(zhēng)性包合作用，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的金剛烷胺測(cè)定的新方法。鹽酸黃連素(berberine hydrochloride，BRH)又稱(chēng)小檗堿，是一種天然的異喹啉生物堿[12]，具有一定的抗微生物活性及抗菌消炎功效[13]。黃連素的水溶液熒光很弱，當(dāng)有羥丙基-β-環(huán)糊精及葫蘆[7]脲等大環(huán)分子存在時(shí)，熒光顯著增強(qiáng)，該現(xiàn)象可能是由于黃連素與大環(huán)分子之間形成了包合物[14-15]?；诖?，本研究試圖建立一種以BRH/HP-β-CD為熒光探針來(lái)測(cè)定金剛烷胺的熒光光譜分析法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

黃連素標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；羥丙基-β-環(huán)糊精，美國(guó)Sigma公司；金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、硬脂酸鎂，國(guó)藥試劑有限公司；所用試劑均為分析純，試驗(yàn)前未進(jìn)一步純化。分別配制1×10-3mol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精、黃連素、金剛烷胺貯備液并置于25 mL 棕色容量瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

FS5型熒光分光光度計(jì)，英國(guó)愛(ài)丁堡公司；FiveEasy型pH計(jì)，上海梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；NW型純水系統(tǒng)，立康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BRH/HP-β-CD/AMD系統(tǒng)的熒光光譜響應(yīng)的測(cè)定 以350 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，采用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定5×10-4mol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精、黃連素、金剛烷胺、黃連素/羥丙基-β-環(huán)糊精、黃連素/羥丙基-β-環(huán)糊精/金剛烷胺溶液熒光發(fā)射光譜圖。

1.2.2 HP-β-CD對(duì)BRH溶液熒光增敏作用的測(cè)定 移取1 mL 5×10-4mol·L-1黃連素樣品溶液于10 mL比色管中，逐漸加入適量的5×10-4mol·L-1的羥丙基-β-環(huán)糊精樣品溶液，超純水定容并充分震蕩后，室溫下超聲15 min，待溶液達(dá)到平衡后，以350 nm為激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定其熒光發(fā)射光譜。

1.2.3 HP-β-CD與BRH溶液包合比的測(cè)定 配制一系列不同濃度的羥丙基-β-環(huán)糊精和黃連素的混合溶液，維持總濃度為 1×10-4mol·L-1，改變HP-β-CD在總?cè)芤褐械哪柋嚷?0～1)，以350 nm為激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行熒光光譜的掃描，記錄其在540 nm處的熒光強(qiáng)度最大值，并計(jì)算出熒光猝滅值(△F)[16]。

1.2.4 金剛烷胺對(duì)BRH/HP-β-CD包合物的熒光猝滅作用的測(cè)定 將5×10-4mol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精、黃連素樣品溶液等體積混合，在室溫下超聲15 min，向比色管中加入適量的金剛烷胺樣品溶液，超純水定容至100 mL，超聲(25 kHz)15 min，待溶液達(dá)到平衡后，將其置于1 cm 比色皿中，以350 nm為激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行熒光光譜的掃描。

1.2.5 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度影響的測(cè)定 分別移取1×10-2mL BRH/HP-β-CD和BRH/HP-β-CD/AMD混合溶液加入到裝有不同pH值(2～12)BR緩沖液的10 mL比色管中，超聲震蕩混勻，測(cè)定其在540 nm處的熒光強(qiáng)度最大值。

1.2.6 共存物干擾的測(cè)定 在BRH/HP-β-CD/AMD系統(tǒng)中，分別加入濃度為金剛烷胺濃度3 000倍的淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、硬脂酸鎂6種常見(jiàn)賦形劑[17]溶液，并測(cè)定混合溶液在540 nm處的熒光強(qiáng)度最大值。

1.2.7 藥物分析 首先將10粒鹽酸金剛烷胺藥片研磨成粉末，稱(chēng)量相當(dāng)于10 mg藥物粉末，超聲溶解后定容至100 mL。取10 mL溶液進(jìn)一步稀釋10倍得到10 mg·L-1的鹽酸金剛烷胺溶液。隨后按照試驗(yàn)需求稀釋至所需樣品溶液，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定，并根據(jù)線(xiàn)性方程計(jì)算金剛烷胺濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 BRH/HP-β-CD/AMD系統(tǒng)的熒光光譜響應(yīng)

羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)作為β-環(huán)糊精的類(lèi)似物，具有與β-環(huán)糊精相類(lèi)似的“內(nèi)疏水外親水”的結(jié)構(gòu)特性，使得其能夠作為主體分子與許多客體熒光分子形成包合物。為進(jìn)一步研究主客體競(jìng)爭(zhēng)性包合作用的光譜變化，本研究測(cè)定了BRH/HP-β-CD/AMD系統(tǒng)的熒光發(fā)射光譜圖(圖1)。結(jié)果表明，HP-β-CD和金剛烷胺(AMD)幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)，黃連素(BRH)具有較弱的熒光，而B(niǎo)RH/HP-β-CD的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，當(dāng)向兩者的混合溶液中加入AMD溶液時(shí)，熒光強(qiáng)度又逐漸減弱。故依據(jù)此現(xiàn)象，建立一種金剛烷胺檢測(cè)的新方法。

圖1 不同混合溶液的熒光發(fā)射光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectra of different mixed solutions

2.2 HP-β-CD對(duì)BRH溶液熒光增敏作用

由圖2可知，酸性條件下，向BRH水溶液中加入不同濃度的HP-β-CD時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(Ⅰp/Ⅰp0=6.42, λmax(em)=550 nm)且發(fā)生輕微紅移，這是由于HP-β-CD與BRH水溶液之間形成包合物，BRH進(jìn)入到HP-β-CD的空腔中，而HP-β-CD的空腔是疏水，進(jìn)而使BRH處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，避免了水溶液對(duì)其熒光造成的猝滅，從而使熒光強(qiáng)度逐漸增加。

注：箭頭所指方向表示HP-β-CD濃度逐漸增加。Note：The direction of the arrow indicates the concentration of HP-β-CD increased gradually.圖2 HP-β-CD濃度對(duì)BRH溶液熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of HP-β-CD concentration on fluorescence intensity of BRH solution

2.3 HP-β-CD與BRH溶液包合比的測(cè)定

為了更好的確定HP-β-CD與BRH水溶液的結(jié)合比率，采用Job’s曲線(xiàn)計(jì)算包合比。以HP-β-CD的摩爾分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度的變化值(△F)為縱坐標(biāo)繪制Job’s曲線(xiàn)圖(圖3)。隨著HP-β-CD摩爾分?jǐn)?shù)的增大，△F呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)HP-β-CD摩爾分?jǐn)?shù)為0.5時(shí)，其相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，可見(jiàn)HP-β-CD與BRH的最佳包合比為1∶1。

2.4 AMD對(duì)BRH/HP-β-CD包合物的熒光猝滅作用

將HP-β-CD與BRH溶液以最佳包合比1∶1進(jìn)行混合，測(cè)定AMD濃度對(duì)BRH/HP-β-CD包合物熒光強(qiáng)度的影響(圖4)。隨著AMD濃度的增加，包合物的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，AMD進(jìn)入HP-β-CD內(nèi)部，與空腔中的BRH競(jìng)爭(zhēng)疏水環(huán)境，最終將包合物中的BRH置換出來(lái)，形成新的AMD/HP-β-CD包合物，AMD本身沒(méi)有熒光，被置換出來(lái)的BRH溶液與環(huán)境中的水接觸，熒光被猝滅，進(jìn)而引起整個(gè)系統(tǒng)的熒光猝滅效應(yīng)。

圖3 BRH/HP-β-CD包合物的Job’s曲線(xiàn)圖Fig.3 The job’s plot of BRH/HP-β-CD complex

注：箭頭所指方向表示AMD溶液濃度逐漸降低。Note：The direction of the arrow indicated the concentration of AMD decreased gradually.圖4 AMD溶液濃度對(duì)BRH/HP-β-CD混合溶液熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of AMD concentration on fluorescence intensity of BRH/HP-β-CD mixture solution

2.5 AMD工作曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍和檢測(cè)限

在最佳試驗(yàn)條件下，測(cè)定結(jié)果顯示AMD(C)濃度與熒光猝滅值△F之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，在0.05～4.5 mg·L-1范圍內(nèi)，線(xiàn)性方程為△F=460+2 421.33C，相關(guān)系數(shù)為0.989 3， 表明兩者線(xiàn)性關(guān)系良好，檢測(cè)限(S/N=3)為0.03 mg·L-1，表明該結(jié)果能夠用于AMD的檢測(cè)。

2.6 pH值對(duì)BRH/HP-β-CD、BRH/HP-β-CD/AMD熒光強(qiáng)度的影響

在二元包合體系和三元包合體系中，pH值可能會(huì)影響包合物的包合常數(shù)和包合速率，進(jìn)而引起熒光強(qiáng)度的變化，并對(duì)最終的試驗(yàn)結(jié)果造成影響。此外，通常情況下的藥物制劑中可能會(huì)含有酸性或堿性物質(zhì)。為了評(píng)估pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，本試驗(yàn)測(cè)定了pH值為2～12范圍內(nèi)BRH/HP-β-CD，BRH/HP-β-CD/AMD混合物的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，BRH/HP-β-CD的熒光強(qiáng)度整體高于BRH/HP-β-CD/AMD的熒光強(qiáng)度，但兩種情況(添加AMD/不添加AMD)在不同pH值溶液中的熒光強(qiáng)度變化不明顯(圖5)。因此，在測(cè)定過(guò)程中可以忽略pH值對(duì)測(cè)量結(jié)果造成的干擾。

圖5 pH值對(duì)BRH/HP-β-CD、BRH/HP-β-CD/AMD熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of pH value on the fluorescence intensity of the BRH/HP-β-CD and BRH/HP-β-CD/AMD

2.7 藥物賦形劑對(duì)BRH/HP-β-CD/AMD包合物熒光強(qiáng)度的影響

為了確定常見(jiàn)藥物賦形劑是否會(huì)對(duì)金剛烷胺的測(cè)定造成干擾，本試驗(yàn)測(cè)定了6種常見(jiàn)的藥物賦形劑

(乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、硬脂酸鎂)對(duì)BRH/HP-β-CD/AMD混合溶液在540 nm處的熒光強(qiáng)度最大值的影響。結(jié)果表明，各組混合溶液的熒光強(qiáng)度變化值均小于±5%(圖6)，說(shuō)明藥物制劑中的常見(jiàn)的賦形劑對(duì)金剛烷胺的測(cè)定沒(méi)有干擾，該方法對(duì)AMD類(lèi)藥物制劑的測(cè)定具有較好的選擇性。

圖6 藥物賦形劑對(duì)BRH/HP-β-CD/AMD包合物熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of pharmaceutical excipients on the fluorescence intensity of the HP-β-CD/BRH/AMD

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可行性，測(cè)定了3種不同品牌AMD藥片的加標(biāo)回收率。由表1可知，AMD回收率在92%～101%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法是有效的，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，表明該方法具有較好的靈敏度。

表1 AMD的加標(biāo)回收率分析Table 1 The analysis of AMD recovery rate

注：a, b, c 分別表示不同品牌的鹽酸金剛烷胺片。

Note: a, b and c indicate different brands of amantadine hydrochloride particles, respectively.

3 討論

以羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)的熒光包合客體為熒光探針能夠快速、靈敏的測(cè)定藥物分子[18]。HP-β-CD與客體分子形成包合物后能夠顯著提高客體分子的熒光強(qiáng)度，這與陳世界等[19]、張全彩等[20]的研究結(jié)果一致，羥丙基-β-環(huán)糊精分別與中性紅、華法林相互作用形成包合物，二者的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。最佳包合比的確定有兩種方法，一種是Job’s 曲線(xiàn)法[21]，一種是相溶解度法[22]。相溶解度法主要研究包合物的增溶作用，李衛(wèi)華等[23]采用相溶解度法研究了β-環(huán)糊精和HP-β-CD對(duì)美沙拉嗪的增溶作用；鄧媛等[24]同樣采用相溶解度法研究了環(huán)糊精對(duì)納他霉素包合過(guò)程中的增溶作用。Job’s曲線(xiàn)法主要研究包合比和結(jié)合比率等，本研究采用Job’s曲線(xiàn)法測(cè)得HP-β-CD與BRH的包合比為1∶1，這與張鍇等[25]采用相溶解度法測(cè)得的結(jié)果一致。

本研究基于HP-β-CD主客體競(jìng)爭(zhēng)性包合作用檢測(cè)AMD，在其濃度0.05～4.5 mg·L-1范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為0.03 mg·L-1。同樣，Wang等[26]采用葫蘆脲[7]與黃連素包合物作為熒光探針檢測(cè)AMD，線(xiàn)性范圍為0.004～1.0 mg·L-1，檢測(cè)限為0.001 2 mg·L-1；湯曉艷等[27]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞蛋中的AMD殘留，線(xiàn)性范圍為0.001～0.1 mg·L-1，檢測(cè)限為0.002 mg·kg-1；蔡自由等[28]采用微流控芯片測(cè)定金剛烷胺片中的鹽酸金剛烷胺，線(xiàn)性范圍為10～120 mg·L-1, 檢出限為0.6 mg·L-1。綜上，本試驗(yàn)建立的AMD熒光光譜測(cè)定方法具有較好的靈敏度，但其線(xiàn)性范圍和檢測(cè)限還有待進(jìn)一步提高。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了一種基于羥丙基-β-環(huán)糊精主客體競(jìng)爭(zhēng)性包合作用的金剛烷胺藥物熒光色譜檢測(cè)方法。該方法通過(guò)建立BRH/HP-β-CD包合物的熒光猝滅值與金剛烷胺濃度之間的線(xiàn)性關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)金剛烷胺的檢測(cè)，檢測(cè)限為0.03 mg·L-1，并發(fā)現(xiàn)溶液pH值和藥片中常見(jiàn)的賦形劑對(duì)金剛烷胺藥物測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，其回收率在92%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%，具有較好的靈敏度和選擇性，但由于環(huán)境溫度等條件對(duì)包合程度的影響，其靈敏度還有待進(jìn)一步改善。