圓葉錦葵對(duì)Cd處理的光合生理響應(yīng)及Cd富集特征

羅 巧 鄔夢(mèng)晞 龍 月 潘遠(yuǎn)智,* 趙 胤 李 青 韓盼盼

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130；2 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850000)

鎘(Cd)的生物毒性強(qiáng)、持久、化學(xué)活性大，易被植物吸收[1]。研究表明，一定濃度的Cd會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出植株變黃、生長(zhǎng)速率減慢、植株矮小等毒害癥狀，高濃度Cd甚至?xí)?dǎo)致植物死亡[2-3]。超富集植物是清理Cd污染的理想材料，與非超富集植物相比，超富集植物對(duì)Cd毒害會(huì)表現(xiàn)出不同的生理響應(yīng)，如在形態(tài)反應(yīng)及光合作用等方面[4]。Cd脅迫下，凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)的變化是影響植株生長(zhǎng)的主要因素之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd處理濃度的增加，Cd超富集植物AtriplexhalimusL.和Arthrocnemummacrostachyum的Pn和光合色素含量均顯著降低，導(dǎo)致其光合作用下降[5-6]。研究表明，光合生理是Cd脅迫下最敏感的生理過程之一，也是反映植物對(duì)Cd耐受性的重要指標(biāo)之一[7]。Cd脅迫下，不同植物的光合耐性和富集特征存在一定差異[4]。因此，研究植物在Cd脅迫下的光合生理特性和富集特征具有重要意義。

研究表明，從園林地被植物中篩選出的具有超富集特征的植物，不僅能修復(fù)Cd污染土壤，還能增強(qiáng)景觀效果[8]。但目前關(guān)于園林植物在修復(fù)土壤污染物適用性方面的系統(tǒng)性研究尚鮮見報(bào)道。圓葉錦葵(MalvapusillaSmith)屬錦葵科錦葵屬多年生草本植物，多用于園林綠化，具有分布范圍廣、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)[9]。本研究通過盆栽試驗(yàn)，分析Cd脅迫下圓葉錦葵的生長(zhǎng)、光合氣體交換參數(shù)、光合色素含量、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)]活性的變化及其對(duì)Cd的富集特征，探討圓葉錦葵對(duì)Cd的光合耐性和富集能力，以期為土壤Cd污染修復(fù)材料的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

圓葉錦葵種子(均為F1)購自四川藍(lán)翔園藝種子公司。種子經(jīng)消毒后置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行育苗，30 d后選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的幼苗作為供試苗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)場(chǎng)地位于四川省成都市溫江區(qū)成都市農(nóng)林科學(xué)院設(shè)施大棚內(nèi)。設(shè)施大棚內(nèi)年度平均氣溫23℃，最低氣溫14℃，最高氣溫29℃，周圍無污染源，屬于重金屬未污染區(qū)。采用土壤盆栽模擬法，供試土壤取自野外田間0～20 cm表層自然土壤，其理化性質(zhì)為pH值6.5、有機(jī)質(zhì)含量23 mg·kg-1、速效氮19.2 mg·kg-1、速效磷62.4 mg·kg-1、速效鉀59.2 mg·kg-1，土壤Cd背景值為0.07 mg·kg-1。設(shè)置Cd濃度為0(CK)、5、15、30、60、100 mg·kg-16個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。將 Cd以CdCl2·2.5H2O(試劑為分析純)的形態(tài)加入到土壤中，混拌均勻后裝入塑料栽培盆(直徑25 cm，高19 cm)中，靜置4周。將試驗(yàn)苗移栽至栽培盆中，每盆栽種2株試驗(yàn)苗。將植株移至設(shè)施大棚內(nèi)，不定期噴灑少量水(不含Cd)，保持盆內(nèi)持水量70%，試驗(yàn)處理周期為60 d。

1.3 測(cè)定方法

處理60 d后，于晴天上午的9: 00-11: 30，對(duì)同一處理組植物的頂生葉片，采用LI-6400 XT便攜式光合測(cè)定儀(LI-COR公司，USA)測(cè)定各處理植株葉片的光合氣體交換參數(shù)[Pn、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance， Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr) 和胞間CO2濃度 (intercellular CO2concentration，Ci)]，紅藍(lán)光源光強(qiáng)為1 000 μmol·m-2·s-1，CO2濃度控制在500 μmol·mol-1。取適量鮮葉用于光合色素含量和抗氧化酶(SOD、CAT、POD、APX)活性測(cè)定：采用丙酮浸提法測(cè)定光合色素含量；NBT還原法測(cè)定SOD活性；愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性；采用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性；采用抗壞血酸反應(yīng)體系測(cè)定APX活性[10]。將植株從盆中取出并沖洗干凈，用20 mmol·L-1EDTA-Na溶液浸泡15 min，再用去離子水將其沖洗干凈，吸水紙吸干水分后稱量植株鮮重；然后105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，稱量其干重，并將其磨粉后過100目篩備用。植株及土壤樣品均采用 HNO3-HClO4法消化(v∶v=5∶1)，利用AA-700原子吸收分光光度計(jì)(島津，日本)測(cè)定樣品中的重金屬Cd含量。利用EPSON Scan掃描儀(愛普生公司，美國)對(duì)葉片進(jìn)行掃描；WinRHIZO Pro 2012b獲取相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0和Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；Tukey HSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)；spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析(雙尾檢驗(yàn))。生物富集系數(shù)(biological concentration factor，BCF)、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(translocation factor，TF)可以評(píng)估植物對(duì)重金屬的修復(fù)效率，按照公式分別計(jì)算BCF、TF[11-12]：

BCF=地上部分Cd濃度/土壤中Cd處理濃度

(1)

TF=地上部分Cd濃度/地下部分Cd濃度

(2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cd處理對(duì)圓葉錦葵生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，隨著Cd處理濃度的增加，圓葉錦葵的干重、株高、葉面積和株莖均呈先升高后降低的趨勢(shì)。與CK相比，Cd處理組的干重、株高均顯著升高。當(dāng)Cd處理濃度為30 mg·kg-1時(shí)，圓葉錦葵的干重、株高、葉面積和株莖均達(dá)到最大值，分別為CK的3.18、1.93、3.34和1.35倍；當(dāng)Cd處理濃度為100 mg·kg-1時(shí)，與CK相比，圓葉錦葵的干重、株高、葉面積和株莖分別增長(zhǎng)了22.83%、20.87%、7.17%和15.12%。5～60 mg·kg-1Cd處理組的葉面積分別較CK顯著增長(zhǎng)178.38%、186.39%、233.51%和83.21%，而100 mg·kg-1Cd處理組與CK間無顯著差異。結(jié)果表明，5～100 mg·kg-1Cd處理促進(jìn)了植株生長(zhǎng)，其中以30 mg·kg-1Cd處理對(duì)植株的促進(jìn)生長(zhǎng)作用最大。由圖2可知，5～100 mg·kg-1Cd處理的圓葉錦葵葉片沒有表現(xiàn)出明顯的毒害癥狀。

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase indicate significant difference at 0.05 level among treatment. The same as following.圖1 不同Cd濃度下圓葉錦葵的生長(zhǎng)響應(yīng)Fig.1 The growth response of Malva pusilla Smith under different Cd concentration

圖2 不同Cd濃度下圓葉錦葵的葉片形態(tài)Fig.2 The leaf morphology of Malva pusilla Smith under different Cd concentration

2.2 不同濃度Cd處理對(duì)圓葉錦葵光合氣體交換參數(shù)的影響

由圖3可知，Cd處理對(duì)圓葉錦葵的Pn、Tr、Gs、Ci均有顯著性影響(P<0.05)。隨著Cd處理濃度的增加，Pn、Tr和Gs的變化趨勢(shì)基本一致，均呈先增加后減小的趨勢(shì)，且在5 mg·kg-1Cd處理下達(dá)到最大值，分別較CK顯著增加了67.13%、41.33%和22.73%。5～60 mg·kg-1Cd處理時(shí)，Pn和Tr均顯著高于CK，而100 mg·kg-1Cd處理時(shí)，Pn和Tr則顯著低于CK。隨著Cd處理濃度的增加，Ci呈逐漸減小的趨勢(shì)，100 mg·kg-1Cd處理時(shí)最低，較CK顯著降低19.57%。綜上，5～60 mg·kg-1Cd處理提高了圓葉錦葵的Pn和Tr，而100 mg·kg-1Cd處理則抑制了Pn和Tr；隨著Cd處理濃度的增加Ci一直受到抑制。

圖3 不同Cd濃度下圓葉錦葵的光合氣體交換參數(shù)Fig.3 The photosynthetic response of Malva pusilla Smith under different Cd concentration

2.3 不同濃度Cd處理對(duì)圓葉錦葵光合色素含量的影響

植物的光合作用主要取決于光合色素的含量，含量高則代表植物光合作用較強(qiáng)[13-14]。光合色素包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素。隨著Cd處理濃度的增加，葉綠素a含量呈上升的趨勢(shì)，100 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值，是CK的1.24倍(圖4-A)；葉綠素b含量和總?cè)~綠素含量均呈先上升后降低的趨勢(shì)，且均在5 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值，分別較CK顯著增加68.86%和31.83%(圖4-B、C)；類胡蘿卜素含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，在30 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值，較CK顯著增加了46.32%(圖4-D)。結(jié)果表明，Cd處理促進(jìn)了圓葉錦葉片中光合色素含量的增加，5～100 mg·kg-1Cd處理下植株的光合色素含量均顯著高于CK。

圖4 不同Cd濃度下圓葉錦葵的光合色素含量Fig.4 The photosynthetic pigment content of Malva pusilla Smith under different Cd concentration

2.4 不同濃度Cd處理對(duì)圓葉錦葵葉片抗氧化酶活性的影響

由表1可知，5～100 mg·kg-1Cd處理對(duì)圓葉錦葵葉片MDA含量及抗氧化酶(SOD、CAT、POD、APX)活性均有一定的影響。隨著Cd處理濃度的增加，MDA含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在5 mg·kg-1Cd的處理時(shí)達(dá)到最大值，5～60 mg·kg-1Cd處理的MDA含量均顯著高于CK。隨著Cd處理濃度的增加，SOD、POD活性均呈逐漸增加的趨勢(shì)，均在100 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值，分別較CK顯著增加了62.55%、256.90%；而CAT、APX活性隨著Cd處理濃度的增加，呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在30和5 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值，分別較CK顯著增加94.54%、119.20%，但二者在100 mg·kg-1Cd處理時(shí)的活性均顯著低于CK。

2.5 不同濃度Cd處理下，圓葉錦葵對(duì)鎘的富集特征

由表2可知，隨著Cd處理濃度的增加，圓葉錦葵葉片中Cd含量逐漸增加，在100 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值，為CK的352.10倍。100 mg·kg-1Cd處理時(shí)，圓葉錦葵根、莖、葉組織中Cd含量均超過了Cd超富集植物的Cd含量臨界值(100 mg·kg-1DW)，且植物各組織中Cd含量的關(guān)系為莖>根>葉，達(dá)到了鎘超富集植物的臨界條件[15]。Cd處理組中BCF值為1.41～3.31，5 mg·kg-1Cd處理時(shí)達(dá)到最大值(3.31)；所有處理組的TF值為1.03～7.37，其中0～60 mg·kg-1Cd處理的TF值無顯著差異，100 mg·kg-1Cd處理時(shí)的TF值顯著增加，達(dá)到最大值(7.37)，是CK的3.00倍。結(jié)果表明，圓葉錦葵對(duì)Cd具有很強(qiáng)的富集能力，同時(shí)具有很強(qiáng)的將地下部分Cd向地上部分(莖、葉)轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，可能是一種潛在的Cd超富集植物。

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Different lowercate in the same column indicate significant difference at 0.05 level among treatments.The same as following.

表2 Cd處理下圓葉錦葵根、莖、葉中Cd含量及其生物富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)Table 2 Cd content in plant tissues and BCF, TF of Malva pusilla Smith grown under Cd treatment

注：“-”表示數(shù)據(jù)不存在。

Note: ‘-’ indicates data doesn′t existed.

3 討論

3.1 Cd對(duì)光合氣體交換參數(shù)的影響

Cd脅迫會(huì)影響植物的光合氣體交換參數(shù)。Ci值的變化趨勢(shì)可以作為判斷氣孔限制和非氣孔限制的依據(jù)[16]。研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫對(duì)潛在的Cd超富集植物地膽草的氣體交換產(chǎn)生了消極影響，表現(xiàn)為Pn、Tr降低[7]。本研究中，Cd脅迫下植物的Pn、Gs和Ci表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，說明Pn下降的主要原因是氣孔因素；隨著Cd脅迫濃度的增加，植物的Pn、Tr和Gs逐漸降低，而Ci則逐漸升高，表明其光合作用下降的主要原因是非氣孔因素[16-18]。簡(jiǎn)敏菲等[19]研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下，苧麻在早期的Pn、Gs、Tr升高，而Ci降低，說明短時(shí)間脅迫能有效刺激苧麻的光合作用，其光合作用由氣孔因素和非氣孔因素影響。這與本研究結(jié)果一致。Ci的下降可能有兩方面原因：一是高光合作用引起的Ci下降；二是可能與Cd對(duì)光合色素、光合組織及光合作用過程的影響有關(guān)[20]。由此推斷，0～5 mg·kg-1Cd處理時(shí)其光合作用受氣孔因素和非氣孔因素影響。5～100 mg·kg-1Cd處理時(shí)圓葉錦共葵的Pn、Tr、Gs和Ci均減小，Pn主要受氣孔因素影響而顯著下降。說明圓葉錦葵葉片Pn的變化既有氣孔因素，又有非氣孔因素的影響。這是由于Cd脅迫引起氣孔開度減少甚至關(guān)閉，CO2無法進(jìn)入葉片，葉片內(nèi)淀粉的水解作用加強(qiáng)，光合產(chǎn)物運(yùn)出緩慢，使得糖分累積，呼吸消耗增加等，從而導(dǎo)致光合速率降低[20]。

研究表明，較高的蒸騰作用可以促進(jìn)根部吸收更多的營(yíng)養(yǎng)元素參與代謝活動(dòng)[21]。本研究中，5～60 mg·kg-1Cd處理組的Tr顯著高于CK，這可能是5～60 mg·kg-1Cd處理的干重均顯著高于CK的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)番茄對(duì) Cd 的吸收與蒸騰作用呈正相關(guān)關(guān)系，表明植物的蒸騰作用在對(duì)重金屬的吸收過程中起著重要作用[22]；研究表明，Tr的顯著上升有助于Cd向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)[17]，這可能是圓葉錦葵葉片中Cd含量增加和具有較高轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的原因之一。

3.2 Cd對(duì)光合色素含量的影響

Cd對(duì)植物光合作用的影響主要表現(xiàn)為Cd對(duì)植物的光合色素等有破壞作用，進(jìn)而影響植物的光合效率[20-21]。Cd2+對(duì)植物光合作用的影響是一個(gè)系統(tǒng)而復(fù)雜的過程，相關(guān)機(jī)理研究尚處于探索階段[17,20-21]。葉綠素的含量決定了植物光合作用的強(qiáng)弱，重金屬脅迫下，葉綠素含量的變化可反映重金屬對(duì)植物的損害狀況[23]。研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cd脅迫下，短期內(nèi)Cd對(duì)葉綠素的合成有刺激作用，超過一定濃度后，則對(duì)葉肉組織產(chǎn)生危害作用，破壞葉綠素結(jié)構(gòu)，抑制葉綠素的合成，從而導(dǎo)致葉綠素含量降低[24-25]。Cd脅迫下，黃麻[18]、美洲狼尾草[26]葉片中光合色素含量顯著降低；超富集植物歐洲千里光[27]幼苗總?cè)~綠素含量顯著降低。也有研究表明，Cd脅迫下植物會(huì)產(chǎn)生一定的保護(hù)機(jī)制[28]。如印度芥菜[29]通過將Cd儲(chǔ)存在葉片的表皮毛中，避免重金屬對(duì)光合作用的損害。而本研究中，隨著葉片中Cd含量的增加，5～100 mg·kg-1Cd處理的光合色素含量均顯著高于CK，這可能是由于葉片耐受Cd的臨界閾值遠(yuǎn)大于100 mg·kg-1，使得圓葉錦葵對(duì)Cd具有較高的耐性，因而5～100 mg·kg-1Cd處理對(duì)圓葉錦葵光合色素的含量產(chǎn)生了促進(jìn)作用，這與蓖麻[30]在Cd脅迫下光合色素含量下降的研究結(jié)果不一致。

在植物體內(nèi)，類胡蘿卜素的作用主要體現(xiàn)在吸收光能、避免葉綠素和葉綠體的光氧化損失、清除葉片內(nèi)活性氧自由基等方面[20,31]。研究發(fā)現(xiàn)，0～150 mg·kg-1Cd脅迫下，植物的類胡蘿卜素含量均高于葉綠素含量[32]，這與本研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)槊{迫條件下植物的類胡蘿卜素含量增加，較高的類胡蘿卜素可以對(duì)三線態(tài)葉綠素進(jìn)行猝滅，清除氧自由基，以此提高天線色素的熱耗散，使 PSⅡ反應(yīng)中心免遭破壞[33]。在本研究中，5～100 mg·kg-1Cd處理增加了類胡蘿卜素的含量，較多的類胡蘿卜素可以清除葉片內(nèi)的活性氧自由基，進(jìn)而緩解圓葉錦葵的氧化脅迫，這可能是引起5～100 mg·kg-1Cd處理下MDA含量降低的原因之一。

3.3 Cd脅迫下抗氧化酶與光合作用的關(guān)系

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Cd處理下，圓葉錦葵葉片Pn的變化既受氣孔因素又受非氣孔因素的影響。0～5 mg·kg-1Cd處理下的光合作用受氣孔因素和非氣孔因素(葉面積、光合色素和抗氧化酶等)的影響；而5～100 mg·kg-1Cd處理下的光合作用受到氣孔因素影響。Cd處理下，圓葉錦葵表現(xiàn)出較強(qiáng)的光合耐性，對(duì)Cd具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和超富集特征，是一種潛在的Cd超富集植物。然而，Cd處理下圓葉錦葵的光合耐受和超富集Cd的機(jī)制尚不清晰，今后可通過生理、細(xì)胞及分子水平的研究進(jìn)一步闡明其對(duì)Cd的解毒和富集原因。