一株高效降解玉米赤霉烯酮的耐酸耐高溫枯草芽孢桿菌的研究

耿海榮 張晨曦 趙月菊 劉 陽(yáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是一種酚的二羥基苯酸內(nèi)酯化合物，是由鐮刀菌產(chǎn)生的一類次生代謝物質(zhì)，是世界上污染范圍最廣泛的鐮刀菌毒素之一[1]。ZEN與雌二醇結(jié)構(gòu)相似，具雌激素活性，在人和動(dòng)物中積累誘發(fā)一系列雌激素效應(yīng)，包括影響雌性哺乳動(dòng)物乳房發(fā)育，導(dǎo)致其產(chǎn)生發(fā)情周期紊亂、外陰道炎、假孕不孕、流產(chǎn)、死胎畸胎等癥狀。此外，有研究證實(shí)ZEN還具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致腫瘤毒性[2-6]。近年來(lái)，全國(guó)各地谷物及其加工制品檢測(cè)的ZEN含量均有超標(biāo)現(xiàn)象[7]。戎曉平等[8]采用免疫親和柱凈化、高效液相色譜法檢測(cè)2014年和2015年179份包括麩皮、玉米、青貯飼料、配合飼料等飼料原料的ZEN含量，測(cè)得樣品ZEN檢出率在90%以上，玉米樣品的ZEN含量和超標(biāo)率最高，最高含量為3 387.00 μg·kg-1，超標(biāo)率為23.21%。國(guó)外谷類作物和谷類制品也不同程度地受到ZEN 的污染，對(duì)近6年國(guó)外多個(gè)國(guó)家1 230份樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ZEN檢出率在95%以上，最高含量為807.5 μg·kg-1[8]。由此可見，谷物和飼料原料中ZEN的污染嚴(yán)重，應(yīng)引起足夠重視。因此，解決ZEN在谷物和飼料原料中的脫毒問(wèn)題迫在眉睫。通過(guò)對(duì)糧食及飼料進(jìn)行脫毒處理，不僅可以挽回經(jīng)濟(jì)損失，還可以從源頭上預(yù)防ZEN中毒等問(wèn)題，從而保障人畜健康[9-10]。

路子顯等[11]闡述了ZEN及其6個(gè)衍生物的分子結(jié)構(gòu)，以及ZEN的生物合成途徑，為ZEN生物工程降解研究提出了建議。目前，污染ZEN的谷物脫毒的主要方法有物理法、化學(xué)法和生物法[12-13]。ZEN的熱穩(wěn)定性極強(qiáng)，120℃條件下加熱4 h，仍不能被有效分解[14]。Abd AlLa等[15]在80℃的條件下，采用10%雙氧水對(duì)含ZEN的玉米進(jìn)行處理，16 h后ZEN降解率僅83.9%。傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法的脫毒效果不穩(wěn)定，易影響谷物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[16-17]。而生物學(xué)方法具有高效性、專一性，且反應(yīng)條件溫和、無(wú)化學(xué)殘留，具有廣泛的應(yīng)用前景[18-20]。Yu等[21]使用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，在土壤中分離到一株能夠降解ZEN的菌株SM04，經(jīng) 16S rDNA 序列分析鑒定為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)，鑒定出其對(duì)ZEN有脫毒功能的是過(guò)氧化物酶(peroxiredoxin，EC 1.11.1.15)。Abdulla等[22]從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputid)中克隆出編碼ZEN降解酶的基因。此外，研究表明，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、毛孢酵母菌(Trichosporonmycotoxinivorans)、 藤黃微球菌(Micrococcusluteus)等具有降解ZEN的能力[23-24]。目前所獲得的ZEN降解菌的培養(yǎng)條件為溫度28～37℃、偏堿性。但在食品和飼料加工過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)酸性和高溫環(huán)境的處理，因此，降解ZEN的耐酸耐高溫菌株的獲得顯得尤為重要。本研究采集酸性高溫環(huán)境下的土壤、水樣等，采用富集培養(yǎng)的方式，使用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(minimal medium)加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，篩選出能夠降解ZEN的耐酸耐高溫菌株，通過(guò) 16S rDNA 鑒定及生化特性分析明確菌株種屬，并研究該菌株生長(zhǎng)和降解特性，同時(shí)分析其降解活性物質(zhì)及降解產(chǎn)物，以期為食品和飼料加工中ZEN的脫毒提供菌株資源和應(yīng)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與主要試劑 從不同地區(qū)熱泉、火山口、醋廠等酸性、高溫環(huán)境條件下采集土壤樣品、水樣品等，于-20℃保存。玉米赤霉烯酮(ZEN)標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)購(gòu)自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)等相關(guān)分子試劑購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(minimal medium，MM)：Na2HPO41.6 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、NaNO30.5 g·L-1、(NH4)2SO40.5 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.025 g·L-1、2 mL微量金屬溶液及1 mL維生素溶液。其中，微量金屬溶液配方為FeCl2·4H2O 1.5 g·L-1、CoCl2·6H2O 0.19 g·L-1、MnCl2·4H2O 0.1 g·L-1、ZnCl20.07 g·L-1、H3BO30.062 g·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.036 g·L-1、NiCl2·6H2O 0.024 g·L-1、CuCl2·2H2O 0.017 g·L-1；維生素配方為生物素2 mg·L-1、葉酸 2 mg·L-1、硫銨素-鹽酸鹽5 mg·L-1、核黃素5 mg·L-1、吡哆醇鹽酸鹽10 mg·L-1、維生素B1250 mg·L-1、煙酸5 mg·L-1，泛酸鈣5 mg·L-1、對(duì)氨基苯甲酸5 mg·L-1、硫辛酸5 mg·L-1。

營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、NaCl 5 g·L-1。

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g·L-1、酵母提取物 5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 DU800紫外/可見分光光度計(jì)儀，美國(guó) Beckman Coulter公司；T100 PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；SPARK 20M全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；SCIENTZ-950超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解ZEN菌株的篩選 稱取樣品10 g于200 mL無(wú)菌三角瓶中，加入無(wú)菌水90 mL，室溫震蕩2 h后靜置30 min。ZEN降解菌的分離和篩選參考文獻(xiàn)[25-27]：取菌液100 μL，加入1 860 μL MM培養(yǎng)基，再加入40 μL ZEN標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg·mL-1)，使ZEN標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為2 μg·mL-1，然后置于28℃、180 r·min-1恒溫培養(yǎng)72 h。吸取1 mL培養(yǎng)液，加入等體積三氯甲烷渦旋震蕩2 min，12 000 r·min-1離心10 min，收集分層后的下層液體于10 mL離心管中。利用三氯甲烷反復(fù)抽提3次，60℃氮吹萃取液至干，再用1 mL 70%乙腈水溶液(流動(dòng)相)復(fù)溶，應(yīng)用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD)檢測(cè)ZEN濃度。將有顯著降解效果的富集液涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，挑取不同的單菌落，首先接種于LB培養(yǎng)基中，并于28℃搖床(180 r·min-1)恒溫培養(yǎng)24 h，再按5%(v/v)的接種量接種到含有2 μg·mL-1ZEN毒素的MM培養(yǎng)基中，以僅含相同濃度ZEN毒素的MM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，在28℃搖床(180 r·min-1)恒溫培養(yǎng)72 h后，用氯仿抽提3次，氮吹至干。用1 mL乙腈/水(流動(dòng)相，7/3，v/v)復(fù)溶，HPLC-FLD檢測(cè)ZEN濃度并對(duì)比對(duì)照組篩選具有高效降解ZEN的單一菌株。

1.2.2 ZEN毒素的檢測(cè) 利用HPLC-FLD檢測(cè)ZEN毒素[28-32]，具體檢測(cè)條件為：安捷倫ZorbaxSB-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈/水(7/3，v/v)；流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣體積20 μL；激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm。

1.2.3 ZEN降解菌的鑒定 ZEN降解菌形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定方法參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[32]。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[33]中的試驗(yàn)方法，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C AG-3′；1492R：5′-T A C C T T G T T A C G A C TT-3′)對(duì)篩選得到的單一菌株的16S rDNA 基因序列進(jìn)行測(cè)定，并將分析測(cè)序結(jié)果在NCBI使用Blast比對(duì)，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得與菌株16S rDNA 源的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)[34-35]，并利用軟件MEGA 7.0中的最大似然法分析該單一菌種的16S rDNA基因與相似種屬的進(jìn)化關(guān)系[36]。

1.2.4 ZEN降解菌最適降解條件分析 挑取ZEN降解菌的單菌落于LB液體培養(yǎng)基活化24 h，按5%(v/v)的接種量分別接種于 LB、NB、MM培養(yǎng)基(pH值7.0)，28℃、180 r·min-1恒溫培養(yǎng)72 h，檢測(cè)其在600 nm波長(zhǎng)下的光密度值(optical density，OD600nm)以分析菌株生長(zhǎng)狀況。每隔9 h取樣檢測(cè)一次，繪制不同培養(yǎng)基條件下ZEN降解菌的生長(zhǎng)曲線。

在確定最適培養(yǎng)基的條件下，按5%(v/v)的接種量接種于液體培養(yǎng)基，選取不同培養(yǎng)溫度(28、37、45、50、55、60和70℃)，于pH值7.0、180 r·min-1恒溫培養(yǎng)24 h，比較不同培養(yǎng)溫度下ZEN降解菌的生長(zhǎng)狀況，確定ZEN降解菌的最適生長(zhǎng)溫度。在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)溫度條件下，按5%(v/v)的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為2 μg·mL-1，對(duì)照組按5%的LB液體培養(yǎng)基加入反應(yīng)體系，孵育36 h，用氯仿抽提毒素3次，氮吹至干，1 mL乙腈/水(流動(dòng)相，7/3，v/v)復(fù)溶，HPLC-FLD檢測(cè)ZEN濃度，并計(jì)算ZEN降解率。

在確定最適培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度的條件下，按5%(v/v)的接種量接種于液體培養(yǎng)基，選取不同pH值(3、4、4.5、5、6、7、8、8.5、9和10)，于50℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，比較不同pH值下ZEN降解菌的生長(zhǎng)狀況，確定ZEN降解菌的最適pH值。在對(duì)應(yīng)的pH值條件下，按5%(v/v)的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為2 μg·mL-1，孵育36 h后計(jì)算此pH值條件下ZEN降解率。

在確定最適降解條件(培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間)后，按5%(v/v)的接種量于液體培養(yǎng)基，在50℃、pH值5.0培養(yǎng)條件下，分析當(dāng)ZEN初始濃度分別為2、4、8、12、16、20 μg·mL-1時(shí)孵育36 h過(guò)程中ZEN降解菌對(duì)高濃度ZEN的降解效果。

1.2.5 ZEN降解菌不同組分對(duì)ZEN降解效果的影響 參考Guan等[37]的方法。挑取單菌落于裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，檢測(cè)OD值光密度約1.7。將菌液于4℃、8 000 r·min-1離心10 min后獲得發(fā)酵上清液和菌體細(xì)胞沉淀。將沉淀的菌體用1×PBS緩沖液(pH值7.4)清洗3次后重懸至原體積。超聲波細(xì)胞破碎儀(輸出功率325 W；總工作時(shí)間25 min；工作/間歇時(shí)間為5 s/5 s)破碎菌體細(xì)胞，4℃、8 000 r·min-1離心10 min，保留上清液，得到細(xì)胞內(nèi)容物。另將同一條件下獲得的重懸菌體細(xì)胞沸水浴15 min，得到滅活菌體。

取50 μL上述所得菌液加入930 μL LB液體培養(yǎng)基，以不加菌液作為對(duì)照；取980 μL發(fā)酵上清液，以LB培養(yǎng)基為對(duì)照；取980 μL上述PBS緩沖液重懸菌體，以PBS緩沖液為對(duì)照；取980 μL所得定容至原體積的細(xì)胞內(nèi)容物，以PBS緩沖液為對(duì)照。將上述不同反應(yīng)液分別加入20 μL ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，使其總濃度為2 μg·mL-1，并于28℃孵育反應(yīng)48 h，提取檢測(cè)反應(yīng)液中的ZEN毒素，分析ZEN降解菌活性成分的分布。

確定發(fā)酵上清液效果后，參考Yu等[21]的方法在發(fā)酵上清液加入蛋白酶K，使其終濃度為1 mg·mL-1，以不加蛋白酶K作對(duì)照。將發(fā)酵上清液沸水浴處理15 min，以未加熱處理上清液為對(duì)照；將發(fā)酵上清液加入十二烷基硫酸鈉(sodium doclecyl sulfate, SDS)，使其終濃度為10 mg·mL-1，以不加SDS為對(duì)照。向上述3種不同處理中，分別加入ZEN并使其終濃度為2 μg·mL-1，然后置于恒溫?fù)u床中28℃、180 r·min-1孵育48 h，提取并檢測(cè)ZEN濃度，比較不同處理對(duì)ZEN降解的影響。

1.2.6 金屬離子對(duì)發(fā)酵上清液降解ZEN效果的影響 將得到的發(fā)酵上清液分別添加Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+以及Li+至終濃度為10 mmol·L-1(分別以MgCl2、ZnSO4、CuSO4、MnCl2和LiCl 的形式添加)，加入ZEN使其終濃度為2 μg·mL-1，以不加金屬離子的處理為對(duì)照(CK)。28℃、180 r·min-1孵育48 h。提取檢測(cè)ZEN濃度，比較分析金屬離子對(duì)ZEN降解酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米赤霉烯酮降解菌的篩選、分離及鑒定

利用無(wú)機(jī)鹽添加ZEN的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，經(jīng)分離純化，獲得一株耐酸、耐高溫高效降解ZEN的菌株 Y-33。由圖1可知，ZEN毒素經(jīng)降解菌Y-33處理后，在ZEN標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(6.80 min)時(shí)，表現(xiàn)為特征性吸收峰顯著降低，初步認(rèn)為菌株Y-33為一株高效降解ZEN的耐酸、耐高溫降解菌。該菌菌液在50℃、pH值5.0條件下孵育36 h，對(duì)2 μg·mL-1ZEN的降解率最高可達(dá)93.79%。分子鑒定結(jié)果顯示，根據(jù) 16S rDNA 測(cè)序分析，經(jīng)Blast比對(duì)和進(jìn)化樹分析(圖2)，鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株。

2.2 ZEN降解菌株Y-33的生長(zhǎng)與降解特性

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)ZEN降解菌株Y-33生長(zhǎng)的影響 由圖3可知，不同培養(yǎng)基提供的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)因素不同，菌株Y-33的生長(zhǎng)狀況也各不相同[38]。菌株Y-33在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況最佳，培養(yǎng)27 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，45 h后進(jìn)入衰退期，故后期試驗(yàn)均采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株Y-33。

注：a：對(duì)照；b：菌株Y-33。Note:a: Control group; b. Strain Y-33.圖1 ZEN的熒光強(qiáng)度分析Fig.1 Fluorescence intensity analysis of ZEN

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Y-33降解ZEN的影響 由圖4可知，培養(yǎng)36 h前，隨著菌體Y-33的不斷繁殖，ZEN降解率快速增大，但隨后ZEN降解率減小，當(dāng)菌體Y-33進(jìn)入衰退期(60～72 h)，ZEN降解率保持在90%左右。培養(yǎng)初期ZEN濃度高，菌株Y-33指數(shù)生長(zhǎng)，ZEN降解速率快；后期隨著ZEN的大量降解，濃度顯著降低，36 h后菌株在穩(wěn)定期的中后期和衰退期的生理變化對(duì)ZEN的降解不再有正向的貢獻(xiàn)，甚至造成降解效率的部分下降，這可能是因?yàn)榫闥-33在穩(wěn)定期的中后期和衰退期時(shí)降解ZEN的活性物質(zhì)減少，而降解活性的有害因子增加等。

圖2 基于16S rDNA序列的菌株Y-33系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain Y-33 based on 16S rDNA sequence

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株Y-33生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of incubation media on the growth of strain Y-33

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Y-33降解ZEN的影響Fig.4 Effects of incubation time on the ZEN degradation of strain Y-33

2.2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株Y-33生長(zhǎng)及ZEN降解率的影響 將菌株Y-33以5%(v/v)接種量加入ZEN標(biāo)準(zhǔn)品使其濃度為2 μg·mL-1，置于不同溫度下LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，發(fā)現(xiàn)該菌株生長(zhǎng)的最高耐受溫度為50℃(圖5-A)，但在此溫度與其在培養(yǎng)溫度分別為28、37及45℃時(shí)的生長(zhǎng)狀況無(wú)顯著差異。由圖5-B可知，不同培養(yǎng)溫度下菌株Y-33降解ZEN的能力不同，但該菌株具有較廣的溫度適應(yīng)能力，在培養(yǎng)溫度28～50℃范圍內(nèi)，其對(duì)ZEN降解率均在68%以上，且當(dāng)培養(yǎng)溫度為50℃時(shí)，ZEN降解率高達(dá)80%，培養(yǎng)溫度為55℃時(shí)，ZEN降解率仍為30%。說(shuō)明菌株Y-33具有一定的耐高溫生長(zhǎng)特性和耐高溫脫毒ZEN的特性。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株Y-33生長(zhǎng)及降解ZEN效果的影響Fig.5 Effects of incubation temperature on the growth and ZEN degradation of strain Y-33

圖6 初始pH值對(duì)Y-33菌株生長(zhǎng)及降解ZEN效果的影響Fig.6 Effects of initial pH value on the growth and ZEN degradation of strain Y-33

2.2.4 初始pH值對(duì)菌株Y-33生長(zhǎng)及ZEN降解率的影響 由圖6-A可知，菌株Y-33的最低生長(zhǎng)耐受初始pH值為5.0，但與其在初始pH值 6、7、8時(shí)的生長(zhǎng)幾乎無(wú)差異。 當(dāng)初始pH值為4.8～7.0時(shí)，菌株Y-33對(duì)ZEN降解率均達(dá)到60%以上，初始pH 值為4時(shí)，ZEN降解率明顯降低(圖6-B)，這與其生長(zhǎng)明顯受抑制有關(guān)；初始pH 值為5.0時(shí)，ZEN降解率達(dá)84%，說(shuō)明菌株Y-33具有一定的耐酸生長(zhǎng)特性和耐酸脫毒ZEN的特性，為食品和飼料加工中ZEN脫毒提供了菌株資源。

2.2.5 不同ZEN初始濃度對(duì)菌株Y-33降解ZEN效果的影響 由圖9可知，不同ZEN初始濃度(2～20 μg·mL-1)下菌株Y-33對(duì)ZEN降解率均在80%以上，且當(dāng)ZEN初始濃度為20 μg·mL-1時(shí)，菌株Y-33對(duì)ZEN的降解率達(dá)82.40%，說(shuō)明菌株Y-33能夠耐受高濃度的ZEN，這為以后ZEN降解菌制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖7 不同ZEN初始濃度對(duì)Y-33菌株降解ZEN效果的影響Fig.7 Effects of difference concentration of ZEN on the degradation of strain Y-33

2.3 菌株Y-33不同組分對(duì)ZEN降解率的影響

將菌液、發(fā)酵上清液、菌體(活性)、細(xì)胞內(nèi)容物及滅活菌體分別與2 μg·mL-1的ZEN毒素在28℃、180 r·min-1孵育48 h。由圖8可知，菌液對(duì)ZEN降解率最高，達(dá)90%以上，其次是菌體(77.35%)、細(xì)胞內(nèi)容物(72.95%)及發(fā)酵上清液(62.02%)，而滅活的菌體降解率僅為6.57%。表明菌株Y-33滅活后其活性成分已經(jīng)失活，對(duì)ZEN幾乎無(wú)降解效果。此外，發(fā)酵上清液和胞內(nèi)容物活性較高，推測(cè)菌株Y-33對(duì)ZEN是酶解作用而非吸附作用。

圖8 菌株Y-33不同組分對(duì)ZEN降解率的影響Fig.8 Effects of different components of strain Y-33 on ZEN degradation

由圖9可知，3種不同處理方式下發(fā)酵上清液對(duì)ZEN降解率均明顯降低，蛋白酶K處理組ZEN降解率最高，僅為9.91%，進(jìn)一步推測(cè)菌株 Y-33 中對(duì)ZEN起到降解作用的活性成分是酶。

圖9 經(jīng)蛋白酶K、SDS、熱處理后發(fā)酵上清液對(duì)ZEN的降解率Fig.9 The degradation ratio of ZEN by cluture supernatant after protease K, SDS and thermal treatment

圖10 不同金屬離子對(duì)Y-33發(fā)酵上清液降解ZEN效果的影響Fig.10 Effects of different metal ions on the degradation of ZEN in the supernatant of strain Y-33

2.4 金屬離子對(duì)發(fā)酵上清液降解ZEN效果的影響

由圖10可知，不同金屬離子對(duì)菌株Y-33發(fā)酵上清液降解ZEN活性的影響較大。當(dāng)加入Mg2+、Li+時(shí)菌株Y-33發(fā)酵上清液對(duì)ZEN降解率分別為45.44%、43.18%，與CK相比，其對(duì)ZEN降解率的影響不明顯。Cu2+、Zn2+嚴(yán)重抑制了Y-33發(fā)酵上清液對(duì)ZEN的降解能力，與CK相比，其ZEN降解率分別下降至25.28%、5.42%。Mn2+明顯增強(qiáng)了Y-33發(fā)酵上清液對(duì)ZEN的降解能力，其ZEN降解率達(dá)81.17%，較CK增加24.25%；而添加EDTA的菌株Y-33發(fā)酵上清液對(duì)ZEN的降解能力基本喪失，主要是因?yàn)镋DTA與金屬離子發(fā)生螯合作用，阻止了金屬離子與酶的結(jié)合以抑制金屬蛋白酶的活性[39]。因此，推測(cè)發(fā)酵上清液中對(duì)ZEN降解是酶的作用，金屬離子對(duì)其活性影響較大。

3 討論

ZEN是世界谷物糧食中污染范圍最廣泛的鐮刀菌毒素之一，對(duì)人畜健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的危害。ZEN脫毒技術(shù)的研究是保障我國(guó)糧食及飼料質(zhì)量安全的一項(xiàng)重要而緊迫的任務(wù)。微生物降解真菌毒素是食品和飼料加工過(guò)程中去除真菌毒素的重要手段之一，釀酒酵母(細(xì)胞數(shù)1×108CFU·mL-1)48 h內(nèi)能將發(fā)酵液中濃度為2.75 μg·mL-1的ZEN完全降解[40-43]；Kakeya等[44]篩選分離到一株粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)菌株IFO07063，該菌株可將ZEN轉(zhuǎn)化為1-(3,5-二羥苯基)-10’-羥基-1’反式十一碳烯-6’-酮，該降解產(chǎn)物無(wú)雌激素活性。芽孢桿菌是研究最多的能降解ZEN的益生菌，Lei等[23]從動(dòng)物食道、發(fā)霉的食物和飼料及土壤等中篩選得到36個(gè)菌株，其中有5個(gè)菌株能降解液體培養(yǎng)基中50%的ZEN，最強(qiáng)的一株對(duì)ZEN的降解率達(dá)到88.65%，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌BacillussubtilisANSB01G。Cho等[45]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌與ZEN共培養(yǎng)36 h時(shí)，能夠清除LB培養(yǎng)基中95.8%的ZEN，在玉米粉培養(yǎng)基中ZEN降解率高達(dá)98%。劉大嶺等[46]篩選分離到枯草芽孢桿菌，制成液體菌劑和固體菌劑，在30℃、4 h條件下污染飼料中ZEN降解率分別為65.5%、62%。本研究從酸性、高溫環(huán)境中篩選分離到耐酸、耐高溫的高效降解ZEN菌株Y-33，鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，Y-33菌液在50℃、pH值 5.0的條件下孵育36 h，菌液對(duì)初始濃度為2 μg·mL-1ZEN的降解率最高達(dá)93.79%，與Cho等[45]的研究結(jié)果類似。此外，本研究得到的菌株Y-33從酸性、高溫環(huán)境中篩選獲得，具有良好的耐酸耐高溫特性，同時(shí)菌株Y-33對(duì)20 μg·mL-1高濃度ZEN的降解率也達(dá)82.40%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株Y-33中起到ZEN降解作用的是胞外活性物質(zhì)，推測(cè)菌株Y-33對(duì)ZEN的脫毒可能是脫氫酶的作用。

4 結(jié)論

本研究從酸性、高溫的熱泉、火山口、醋廠等環(huán)境采集土壤、水樣品，篩選分離得到一株耐酸、耐高溫高效降解ZEN的枯草芽孢桿菌Y-33。采用LB培養(yǎng)基在28～50℃、pH值5～7條件下培養(yǎng)的菌株Y-33對(duì)ZEN的降解效果較好，且菌株Y-33能夠耐受高濃度ZEN。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株Y-33中對(duì)ZEN起到降解作用的活性成分是酶，EDTA、Cu2+、Zn2+可強(qiáng)烈抑制菌株Y-33發(fā)酵上清液中的酶活，Mn2+則顯著增強(qiáng)了菌株Y-33發(fā)酵上清液中的酶活性，Mg2+和Li2+的影響不明顯。本研究為食品和飼料加工過(guò)程中玉米ZEN的去除提供了菌種資源，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。