基于密碼子優(yōu)化的FAD依賴葡萄糖脫氫酶在畢赤酵母中的高效表達及酶學性質

董聰 高慶華 王玥 羅同陽

（河北省科學院微生物研究所，保定 071051）

FAD 依賴的葡萄糖脫氫酶（FAD-dependent glucose dehydrogenase，簡稱 FAD-GDH，EC 1.1.99.10），同葡萄糖氧化酶、吡喃糖脫氫酶、膽堿脫氫酶和甲醇氧化酶一樣都屬于 GMC 氧化還原酶（Glucosemethanol-choline-oxidoreductase） 家 族［1］。 它 是 以FAD 為輔基能夠在 NAD（P）+等存在的情況下催化β-D-葡萄糖生成 D-葡萄糖酸-δ-內酯，而 D-葡萄糖酸-δ-內酯會自發(fā)形成葡萄糖酸。

研究表明，F(xiàn)AD-GDH是一類重要的臨床檢測和工業(yè)用酶，可應用于血糖試紙或葡萄糖生物傳感器的制備、輔酶的再生、新型燃料電池［2］和心臟起搏器［3］的研制等。尤其是可以作為血糖檢測用酶，F(xiàn)AD-GDH不以氧氣作為酶促反應的電子受體，檢測結果更準確，且具有轉化率高、底物特異性好等優(yōu)點，因此有很大的應用前景。

雖然到目前為止已經(jīng)有不少FAD-GDH被分離和鑒定，但是針對特定FAD-GDH全面深入的研究很少，主要原因是FAD-GDH很難實現(xiàn)可溶的重組表達，在大腸桿菌進行重組表達時形成包涵體，不易分離純化。重組表達是克服這一障礙的有效方法。在真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母中有過實現(xiàn)可溶表達，得到有活性的FAD-GDH的報道［4］。畢赤酵母（P. pastoris）表達系統(tǒng)在進行外源基因表達時，具有生長周期短、可進行胞外分泌表達、目的蛋白易于純化和易于高密度發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點［5-7］。由于畢赤酵母對密碼子的偏愛性，目的基因的密碼子序列對產物的表達量也有很大影響。大量研究表明，密碼子優(yōu)化對提高產物表達量有明顯的作用［8-13］。因此，如果想提高產物的產量，不但要優(yōu)化表達條件，還需要對密碼子進行優(yōu)化，以期為FAD依賴的葡萄糖脫氫酶進一步擴大生產提供理論和技術支持，使其更好的應用于血糖檢測及其他相關領域［14］。

本研究以NCBI上登錄號為XM_001216916的土曲霉NIH2624基因為基礎，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對該基因的密碼子進行優(yōu)化，然后委托公司進行基因合成。接著將該基因克隆到畢赤酵母中，并在基因的3′端接上6個組氨酸標簽的核苷酸序列，以便于重組表達蛋白的純化。經(jīng)過篩選和優(yōu)化，得到了高產該FAD-GDH的重組菌株。采用該菌株摸索發(fā)酵條件，實現(xiàn)了該蛋白的高效表達，并對其酶學性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 FAD依賴葡萄糖脫氫酶基因由安徽通用生物公司合成，合成的基因連接在pUC57T載體上；大腸桿菌DH5α購自上海生工；酵母表達菌株X33由中科院微生物研究所提供；質粒pMD由本實驗室前期構建。

1.1.2 酶和主要試劑EcoR I、NotI和SacI限制性內切酶為NEB公司產品；T4 DNA連接酶為Thermo公司產品；DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒和質粒DNA小提試劑盒為天根生化科技有限公司產品；G418為Sigma公司產品；2，6-二氯靛酚鈉（DCIP）為BBL Life Sciences公司產品，BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin為碧云天生物科技有限公司產品；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 培 養(yǎng) 基 LB、YPD、YPDS、YPCS、BMGY和基礎鹽培養(yǎng)基等培養(yǎng)基配方和X33培養(yǎng)條件參照文獻［14］。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖脫氫酶密碼子優(yōu)化及人工合成 以NCBI 上登錄號為 XM_001216916 的土曲霉 NIH2624基因為基礎，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對該基因的密碼子進行優(yōu)化，利用密碼子優(yōu)化軟件http：//www.jcat.de/分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶基因中有多處是畢赤酵母的稀有密碼子，利用密碼子優(yōu)化軟件http：//www.jcat.de/，對蛋白酶基因進行密碼子優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的前提下，獲得優(yōu)化后的蛋白酶的基因序列。利用信號肽預測服務器SignalP，服務器網(wǎng)址http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，預測信號肽，然后去除，在序列的5′ 端加上EcoR I酶切位點，3′端加上6個組氨酸標簽后再加NotI酶切位點。然后將優(yōu)化構建的基因序列送安徽通用生物公司合成，合成的基因連接在pUC57T載體上。

1.2.2 重組表達載體的構建 人工合成的pUC57-GDH和載體pMD經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切后切膠回收純化，然后用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含氨芐的LB平板上篩選陽性克隆，對陽性克隆提取質粒進一步進行酶切驗證，由安徽通用生物公司進行測序分析。

1.2.3 陽性轉化子的獲得 構建好的重組表達載體pMD-GDH經(jīng)SacI線性化后電轉表達宿主P. pastorisX33感受態(tài)細胞，電轉條件：4 Kv，3 ms，然后快速加入1 mL 預冷YPDS液體培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2-6 h，涂布在終濃度為250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后獲得陽性轉化子。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 將重組菌株X33/pMDGDH挑取單菌落接種于5 mL YPCS試管培養(yǎng)基中，14-18 h后加 1%（V/V）甲醇，之后24 h和48 h后均各加 1%（V/V）甲醇誘導，72 h收菌，8 000 r/min離心 5 min收集上清，測定酶活。至少重復3次。

1.2.5 FAD依賴葡萄糖脫氫酶的酶活測定 FAD依賴葡萄糖脫氫酶的酶活測定方法參照文獻［4］，使用DCIP作為電子受體，在30℃反應180 s，測定520nm的吸光值變化。

1.2.6 FAD依賴葡萄糖脫氫酶酶學性質分析 酶的最適作用溫度和pH 以及熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性測定、金屬離子的影響及底物特異性參照文獻［14］。所用的緩沖液均為pH 5.2的磷酸鹽緩沖液。

1.2.7 10 L發(fā)酵罐放大表達FAD-GDH 選取試管水平上FAD依賴的葡萄糖脫氫酶活性最高的轉化子，在10 L 發(fā)酵罐條件下進行FAD-GDH 的表達。挑單克隆接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h，按3%接種量轉接于 100 mL BMGY 培養(yǎng)基至OD600≈6 接種于10 L發(fā)酵罐，初期裝液量為 5.6 L BSM 培養(yǎng)基，高壓滅菌20 min 后，以 10%發(fā)酵體積接種。期間每隔24h加維生素C水溶液（終濃度80 μg/L），28℃培養(yǎng)，每12 h取樣測定發(fā)酵液酶活；上清液進行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察FAD-GDH 蛋白質的表達。具體方法參照文獻［15］。

2 結果

2.1 FAD依賴葡萄糖脫氫酶密碼子優(yōu)化

主要優(yōu)化指標為CAI、密碼子使用相對分布、GC含量、酶切位點等，在不改變氨基酸序列的前提下，在這段優(yōu)化的密碼子序列中，共替換了416個堿基，優(yōu)化后的密碼子序列幾乎全部是畢赤酵母的偏愛密碼子，為目的基因在畢赤酵母中成功表達提供了保障?；蛐蛄腥鐖D1 所示。

2.2 酵母表達載體pMD-GDH的構建

將人工合成包含目的基因的載體和pMD載體分別利用EcoR I和NotI雙酶切，并且利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段和表達載體片段，然后利用T4 DNA連接酶將目的片段連接到表達載體上，并轉化大腸桿菌DH5α中，通過提取質粒，EcoR I/NotI雙酶切鑒定質粒的正確性（圖2）。有 1.7 kb左右的條帶，說明FAD-GDH基因連接到了pMD載體上，然后將pMD-GDH質粒送華大基因測序，測序結果說明目的基因已連接到載體上，且序列正確。

2.3 陽性轉化子的獲得

將酶切正確的重組質粒pMD-GDH進行SacI線性化后電轉表達宿主Pichia pastorisX33，構建重組菌X33/pMD-GDH，涂布在終濃度為250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后獲得陽性轉化子（圖3）。

將重組菌株X33/pMD-GDH挑取單菌落接種于5 mL YPCS試管培養(yǎng)基中，14-18 h后加 1%（V/V）甲醇，之后24 h和48 h后均各加 1%（V/V）甲醇誘導，96 h收菌，8 000 r/min離心 5 min收集上清，上清液利用DCIP的方法測定 FAD 依賴葡萄糖脫氫酶的活力，酶活定義為反應體系中每分鐘反應1 μmol電子受體所需的酶量，并以此來確定重組子是否為陽性。共挑取了18個單菌落誘導培養(yǎng)，測定酶活，重復3次，其中9號酶活較高且穩(wěn)定（圖4），試管中酶活為20.85 U/mL，選其做進一步的研究。

2.4 SDS-PAGE電泳分析

將在試管中誘導表達收集的酶液經(jīng)超濾濃縮后進行SDS-PAGE電泳鑒定，結果如圖5所示，重組畢赤酵母在60-70 kD之間有一條條帶，與理論分子量相符，而pMD空載轉化的酵母沒有類似的條帶。并且用DCIP法測定發(fā)酵液有活性，說明FAD依賴的葡萄糖脫氫酶在酵母體內實現(xiàn)了分泌表達。該基因3′端有His-tag序列，可通過與鎳離子的親和層析進行純化，經(jīng)BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin純化后SDS-PAGE分析結果如圖6所示。

2.5 FAD依賴的葡萄糖脫氫酶酶學性質分析

酶學性質分析結果如圖7-圖9所示，畢赤酵母表達的FAD-GDH最適反應溫度為55℃，在50℃下處理150 min仍有70%的活性。FAD-GDH的最適pH值為7.0，在 pH 4-7 范圍內，37℃保溫4 h，F(xiàn)AD-GDH 仍能保持 50%以上的活性。金屬離子Cu2+對酶活抑制作用比較大。FAD-GDH的底物專一性較好，以葡萄糖為最適底物。當以木糖為底物時，其相對活性是以葡萄糖為底物的36%；對麥芽糖和海藻糖也有一定活性，對其他單糖或二糖不顯示催化活性。

圖1 優(yōu)化后的FAD-GDH基因序列

2.6 10 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)

重組菌P. pastorispMD-GDH在10 L發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)，在菌體生長階段當溶氧DO值在20 h迅速上升（培養(yǎng)基甘油耗盡）時以恒速補加甘油4 h，饑餓培養(yǎng)0.5 h 后開始甲醇誘導。在甲醇誘導階段，通過控制DO 值來流加甲醇以高效誘導重組畢赤酵母產酶，同時可避免過高的甲醇對菌體產生毒害作用，甲醇流加［6 mL/（h·L）］與DO 偶聯(lián)，即DO 值高于0%時補加甲醇，維持DO 0%左右。隨著甲醇添加，F(xiàn)AD依賴葡萄糖脫氫酶酶活不斷提升，甲醇誘導136 h時酶活達到257.6 U/mL（圖10）。此外，對不同時間點的發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE 電泳分析，結果顯示各上清液在SDS-PAGE 圖中有一條清晰條帶，該條帶隨發(fā)酵時間增加而變得濃重清晰，表明發(fā)酵上清液中FAD依賴的葡萄糖脫氫酶含量隨著發(fā)酵時間增加而顯著提高，與酶活增長趨勢保持一致。

圖2 pMD-GDH載體雙酶切鑒定

圖3 X33/pMD-GDH單菌落

圖4 高產FAD依賴葡萄糖脫氫酶重組畢赤酵母的試管篩選

圖5 重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果

圖6 重組蛋白純化結果

圖7 FAD-GDH 酶學性質

圖8 不同金屬離子對 FAD-GDH 的影響

圖9 FAD-GDH 的底物特異性

圖10 上罐發(fā)酵實驗

3 討論

FAD依賴的葡萄糖脫氫酶作為血糖檢測用酶有很大的應用前景，但是在天然宿主菌中的表達量很低，在大腸桿菌進行重組表達時形成包涵體，表達量低，不易分離［16］，給FAD依賴的葡萄糖脫氫酶的工業(yè)應用帶來一定的限制，所以利用基因工程技術實現(xiàn)FAD依賴的葡萄糖脫氫酶的高效表達成了目前研究的重點。酵母表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，與原核表達系統(tǒng)相比，具有很多優(yōu)勢，如生長速度快，可使用高效的AOX 啟動子以及可實現(xiàn)異源蛋白的分泌表達等優(yōu)點，廣泛用于各種具有工業(yè)用途的重組蛋白的生產［58，17］。

本實驗利用酵母表達系統(tǒng)表達FAD依賴葡萄糖脫氫酶，通過分析影響表達量的因素，根據(jù)畢赤酵母對密碼子的偏愛性對該基因序列進行了優(yōu)化［18］，提高其表達量。蛋白酶傳統(tǒng)分離純化方法多采用超濾-陽離子柱-超濾-陰離子柱等步驟，工藝復雜，收率低。本研究在FAD依賴葡萄糖脫氫酶基因3′端加上了6 個組氨酸標簽，可以通過親和層析的方法進行純化，效率高，適合大規(guī)模純化。

在已有的報道中，杉木炭疽病菌來源的 FADGDH 在畢赤酵母中得到了較好的表達，通過采用 7 L 的發(fā)酵罐，發(fā)酵約 50.5 h，產量達到 48 000 U/L報道［14］。本實驗利用酵母表達系統(tǒng)表達FAD依賴的葡萄糖脫氫酶，通過優(yōu)化FAD依賴的葡萄糖脫氫酶密碼子序列，在10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時經(jīng)過136 h誘導培養(yǎng)，酶活達到257 600 U/L，是現(xiàn)有技術中報道的酶活的5.3倍。畢赤酵母可通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)大量生產重組蛋白，在提高產量的同時有利于簡化純化步驟，降低生產成本。

酶學性質是表征一個酶的基本參數(shù)，通過酶學性質的測定和評估，可以了解一個酶的特有性質，為酶的應用和改造提供一系列必要的初始參數(shù)。在血糖檢測用酶中，要求所用的酶有較高的催化效率，較窄的底物譜，良好的熱穩(wěn)定性［19］。周利偉等［14］報道的重組FAD-GDH最適溫度為40℃，本研究畢赤酵母重組表達FAD-GDH的最適反應溫度為55℃，且熱穩(wěn)定性良好，在50℃下處理150 min仍有70%的活性；其次該酶的最適pH值為7.0，在 pH4-7 范圍內，37℃保溫4 h，F(xiàn)AD-GDH 仍能保持 50%以上的活性，有較高的應用價值。金屬離子Cu2+對該酶活抑制作用比較大，與前人研究結果一致。FADGDH的底物專一性較好，以葡萄糖為最適底物。當以木糖為底物時，其相對活性是以葡萄糖為底物的36%；對麥芽糖和海藻糖也有一定活性，與楊愈豐等［20］研究結果相符，對其他單糖或二糖不顯示催化活性。

4 結論

本研究以 NCBI 上登錄號為 XM_001216916 的土曲霉 NIH2624 基因為基礎，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性對該基因的密碼子進行優(yōu)化，將該基因克隆到畢赤酵母中，經(jīng)過篩選和優(yōu)化，得到了高產FAD-GDH 的重組菌株。試管水平酶活達到20 850 U/L；在10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)時經(jīng)過136 h誘導培養(yǎng)，酶活達到257 600 U/L，是現(xiàn)有報道中酶活的5.3倍。然后研究了其酶學性質，pH、溫度穩(wěn)定性和底物專一性較好。