功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)的研究進展

肖冰 羅云波，2 黃昆侖，2 張園 許文濤，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

目前待檢物質(zhì)種類繁多，樣品復(fù)雜，針對不同待檢物質(zhì)的定量檢測方法不一。檢測重金屬離子采用的主要方法是原子吸收法［1］、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法［2］及電感耦合等離子體質(zhì)譜［3］等；針對農(nóng)藥、生物毒素、食品添加劑等污染物的檢測主要是采用液相色譜［4］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法［5］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法，各種傳統(tǒng)定量檢測方法可以準確測定目標(biāo)檢測物的含量，但無法對不同種類的待檢物質(zhì)進行統(tǒng)一的檢測，而功能核酸的出現(xiàn)與其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展可有效地解決這一問題。功能核酸作為一類具有特定空間構(gòu)象、執(zhí)行特異生物功能的天然或者人工核酸序列，可以將各種待檢物質(zhì)統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為核酸信號再結(jié)合功能核酸相關(guān)檢測方法進行檢測。另外，還具有易于修飾、價格低廉、穩(wěn)定性高及特異性強等優(yōu)勢。功能核酸檢測技術(shù)分為靶標(biāo)識別、信號轉(zhuǎn)換輸出兩部分。信號輸出的方式包括比色信號、熒光信號、電化學(xué)信號、化學(xué)發(fā)光信號、熱信號及動力學(xué)信號等。

其中，熒光傳感具有靈敏度高、特異性強以及可進行實時原位檢測的優(yōu)勢，而標(biāo)記型熒光傳感又是熒光傳感中最重要的一部分，結(jié)合功能核酸后，更擴大和增強了其檢測靈敏度、檢測范圍與檢測效率［6-7］，逐漸被廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、疾病診斷相關(guān)多種靶標(biāo)物質(zhì)的檢測［8］。功能核酸在功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)中起到的重要作用主要體現(xiàn)在兩個方面，一是可將多種靶物質(zhì)統(tǒng)一轉(zhuǎn)為較為穩(wěn)定的核酸信號，使現(xiàn)有的熒光檢測的可檢靶物質(zhì)種類增多，擴大檢測范圍；二是由于功能核酸本身可擴增的性質(zhì)，可以在定量檢測中加入信號擴增，使得檢測靈敏度以及檢測效率大大增強。

不同的熒光標(biāo)記型材料與功能核酸結(jié)合后具有不同的發(fā)光、猝滅性質(zhì)，其發(fā)光機制也不盡相同，本文針對不同熒光物質(zhì)與功能核酸結(jié)合的特點將功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)分為熒光標(biāo)記型線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)，熒光標(biāo)記型非線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)，熒光標(biāo)記型功能核酸雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)，并從這幾個角度對功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)與其實際應(yīng)用進行了分類介紹與評價對比，最后討論了該技術(shù)在多種風(fēng)險因子分析中的研究意義以及存在的問題，并為其未來的發(fā)展方向與應(yīng)用前景作出展望。

1 功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)概述及其分類

熒光定量檢測技術(shù)是以紫外或可見光作為激發(fā)光源，照射處于基態(tài)的分子，使其吸收能量，躍遷至激發(fā)態(tài)，進而由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定激發(fā)態(tài)物質(zhì)分子返回基態(tài)過程會散失部分能量，這部分能量轉(zhuǎn)化光能，這種光被稱為熒光，即可利用與檢測的熒光信號［9-10］。熒光定量檢測技術(shù)廣義上是由識別部分、轉(zhuǎn)化部分以及熒光物質(zhì)部分構(gòu)成，其檢測原理是待檢測物被識別部分與轉(zhuǎn)化部分特異性識別、結(jié)合、相互作用并轉(zhuǎn)化為可引起熒光物質(zhì)敏感的信號［11］，進而導(dǎo)致其光物理性質(zhì)發(fā)生變化，主要包括熒光的增強、淬滅和光譜位移等。

通常，在熒光標(biāo)記型功能核酸介導(dǎo)的熒光定量檢測系統(tǒng)的構(gòu)建過程中，需要在核酸分子上面標(biāo)記熒光物質(zhì)，這些用于標(biāo)記的熒光物質(zhì)可分為熒光素類［12-13］、羅丹明類［14-15］、氟硼類染料（BODIPY）［16］、香豆素類［17］、萘酰亞胺、芘類［18-19］、萘類［20］、蒽類及新型熒光物質(zhì)等，根據(jù)檢測對象的特點選擇不同的熒光報告基團以共價鍵形式標(biāo)記在核酸上，這些被熒光標(biāo)記后的核酸分子作為核酸分子熒光探針在生物傳感過程中起到分子識別以及熒光信號報告等功能，根據(jù)其熒光發(fā)光特點可以將熒光標(biāo)記型功能核酸介導(dǎo)的熒光生物傳感技術(shù)分為Light-up（點亮型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)、Scorpions primer（蝎子型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)等。

2 標(biāo)記型熒光定量檢測技術(shù)幾種重要發(fā)光機制以及與核酸結(jié)合的典型應(yīng)用

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是指一個體系含有能量供體與能量受體兩個熒光團，在供體被激發(fā)后可以向受體發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，進而受體發(fā)出熒光［21］。該機理對供體和受體的激發(fā)和發(fā)射光譜、兩者間的距離和排列方式皆有一定要求［22-23］，可應(yīng)用于多種形式的熒光探針中。例如，Shamsipur等［24］基于熒光與猝滅基團的熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，開發(fā)了一種熒光探針介導(dǎo)的針對目標(biāo)靶序列檢測的生物傳感器（圖1-A）。

2.2 π-π堆積激發(fā)態(tài)締合物/復(fù)合物的形成

激發(fā)態(tài)締合物（Excimer，簡稱Er）和激發(fā)態(tài)復(fù)合物（Exicplex，簡稱Ex）分別指激發(fā)態(tài)熒光基團與相同的和不同的基態(tài)熒光基團復(fù)合。激發(fā)態(tài)復(fù)合物與締合物的發(fā)射光譜與基態(tài)相比，會產(chǎn)生紅移，同時其發(fā)射峰呈現(xiàn)強而寬且無精細結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。蒽（anthracene）［25-26］和芘（pyrene）［27］等多環(huán)芳烴熒光團常用于此類探針的設(shè)計。例如，末端標(biāo)有芘分子核酸發(fā)卡探針常被設(shè)計到高靈敏檢測靶標(biāo)物質(zhì)的熒光定量檢測技術(shù)中［28-29］。

2.3 聚集誘導(dǎo)發(fā)光

基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光（Aggregation-Induced emission，AIE）的熒光分子是一類具有螺旋結(jié)構(gòu)的分子，具有游離狀態(tài)不發(fā)熒光，聚集狀態(tài)發(fā)生較強熒光的性質(zhì)［30］。具體機理是當(dāng)這類分子以單體游離態(tài)被激發(fā)光激發(fā)后，被激發(fā)電子以分子內(nèi)振動旋轉(zhuǎn)形式回到基態(tài)，不產(chǎn)生熒光；聚集時，被激發(fā)的電子無法通過分子內(nèi)振動旋轉(zhuǎn)釋放能量回到基態(tài)，而通過輻射方式釋放多余能量，產(chǎn)生熒光。該類熒光分子可以很巧妙的結(jié)合分子溶解性來進行熒光傳感策略的設(shè)計，具有信噪比高、抗漂白能力強的特點［31］（圖 1-B）。

2.4 上轉(zhuǎn)換發(fā)光

上轉(zhuǎn)換納米材料（Upconversion luminescence，UCL）具有優(yōu)異的光學(xué)性能，它能克服傳統(tǒng)發(fā)光材料的多種不足，尤其是其激發(fā)波長位于近紅外區(qū)，可以將低頻率激發(fā)光轉(zhuǎn)換成高頻率發(fā)射光，即吸收多個低能光子使其到達高的激發(fā)態(tài)并最終發(fā)射出一個高能光子的現(xiàn)象，也稱為多光子發(fā)光。以UCNPs作為標(biāo)記材料可有效避免生物樣品的自體熒光和光散射，大大提高了檢測的靈敏度，UCNPs與DNA分子相結(jié)合可構(gòu)建DNA熒光納米探針，在生物領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力［33］。2006年，Wang等［34］利用Yb3+/Er3+離子對共摻NaYF4納米晶體，并結(jié)合磁場力分離技術(shù)對靶標(biāo)DNA進行檢測。

2.5 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photo-induced electron transfer，PET）［35］是指電子給體或電子受體的電荷在激發(fā)光的作用下發(fā)生電子給予或者電子接收的過程，該過程會阻礙熒光基團的電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的過程，引起熒光淬滅，若結(jié)合待檢測物質(zhì)時，熒光團被氧化或還原，可以阻止光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程，使得熒光團恢復(fù)熒光，常用于熒光增強型傳感器設(shè)計，Nagano課題組就基于PET過程構(gòu)建了可以識別一氧化氮及單線態(tài)氧的熒光探針（圖1-C）。

2.6 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，也稱作光致電荷轉(zhuǎn)移（Photoinduced charge transfer，PCT）指分子在激發(fā)光的激發(fā)下，電子在分子內(nèi)部發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成正負電荷分離的狀態(tài)［36］。熒光物質(zhì)以耦合形式連接著給電子和吸電子集團，π鍵可作為電子轉(zhuǎn)移通道，其中電子所受的力越強，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效益就越強，熒光強度越強，光譜波長越長，當(dāng)待檢測物分別與吸電子基團和給電子基團結(jié)合時，分別會使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強和減弱，光譜波長紅移和藍移。例如，圖1-D分子探針的識別基團是其電子受體，分子中的氮雜冠醚與二甲氨基都是電子給體，冠醚和鈣離子絡(luò)合后，冠醚吸電子能力顯著變強，熒光隨之紅移。

2.7 化學(xué)發(fā)光

化學(xué)發(fā)光（Chemical emission）是指物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)生的一種光輻射現(xiàn)象。兩種可發(fā)生自發(fā)反應(yīng)的物質(zhì)反應(yīng)后所釋放的能量激發(fā)另一類物質(zhì)從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，部分能量以輻射形式釋放出來，形成熒光。例如，圖1-E反應(yīng)型汞離子分子熒光探針在溶液中與汞離子結(jié)合后其熒光強度增至34倍之多，并伴隨有光譜紅移，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)反應(yīng)后可得到脫硫化合物。

3 熒光標(biāo)記型線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測技術(shù)是基于標(biāo)記熒光基團或猝滅基團的線性單鏈核酸探針。其原理是在靶標(biāo)物質(zhì)的介導(dǎo)下，核酸探針結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起熒光基團與核酸探針或者熒光基團與猝滅基團間距離、狀態(tài)的變化，再導(dǎo)致熒光信號的變化，通過檢測這種熒光信號的變化定量檢測靶標(biāo)物質(zhì)，該類熒光定量檢測技術(shù)可分為Light-up（點亮型）探針介導(dǎo)型、線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)型與線性雙標(biāo)記探針介導(dǎo)型等典型類型。

圖1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（A）聚集誘導(dǎo)發(fā)光（B）光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（C）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（D）化學(xué)發(fā)光（E）機理圖

3.1 Light-up（點亮型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

Light-up探針是一種單標(biāo)記型核酸探針，可應(yīng)用于定量PCR中，其特性是，游離狀態(tài)時，該類探針中不對稱花青染料噻唑橙，其中，兩個芳香族體系可以圍繞相互連接的亞甲基旋轉(zhuǎn)，物質(zhì)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)以旋轉(zhuǎn)動能釋放多余能量，熒光微弱；芳香族部分被外力如結(jié)合另一條核酸鏈時，變?yōu)閹缀纹矫娼Y(jié)構(gòu)，分子內(nèi)無法旋轉(zhuǎn)，多余能量會以輻射能的形式釋放，轉(zhuǎn)為光能，熒光增強，該類熒光分子可以很巧妙的結(jié)合分子溶解性來進行熒光傳感策略。Svanvik等［32］報道了一種以標(biāo)記有噻唑橙染料的7-9個堿基的肽核酸Light-up探針在實時定量PCR檢測中的應(yīng)用，其選用的電中性核酸模擬物肽核酸比普通探針與靶DNA結(jié)合的更快更穩(wěn)定，在檢測時，將體系加入到實時普通PCR體系中，每輪擴增過程后，在靶物質(zhì)存在時，熒光探針可與再次退火的熱變性模版競爭結(jié)合，每次退火過程后在波長是470 nm的激發(fā)光和波長為530 nm的發(fā)射光的條件下進行熒光強度的讀數(shù)，達到實時定量監(jiān)測PCR過程中產(chǎn)生的特定擴增產(chǎn)物的目標(biāo)（圖2-A）。

3.2 線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測技術(shù)的檢測原理是基于單熒光基團與單猝滅基團的熒光共振轉(zhuǎn)移原理，通過所標(biāo)記的核酸結(jié)構(gòu)改變或通過核酸擴增而改變淬滅基團與熒光基團的距離引起兩者間的熒光共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生或停止，進而引起熒光信號的變化。Li和Lu等［37］于2000年報道了一種用于檢測鉛離子的TAMRA單標(biāo)記功能核酸熒光定量檢測技術(shù)。該傳感器設(shè)計了一條5′端以共價鍵形式標(biāo)有TAMRA熒光基團的20個堿基的8-17DNAzyme底物鏈（其中切割部位為一個RNA堿基）與一條3′端標(biāo)有Dabcyl猝滅基團的含有34個堿基的8-17DNAzyme酶鏈，在沒有鉛離子存在以及解鏈溫度高于室溫的情況下，該條底物鏈會通過Waston-Crick鍵堿基對與其酶鏈相連，呈惰性。另外，在猝滅基團的猝滅作用下體系成低熒光狀態(tài)。環(huán)境pH為6，當(dāng)鉛離子存在時，8-17DNAzyme被激活，催化切割底物鏈，使其接連溫度變低在室溫下呈不穩(wěn)定狀態(tài)，進而標(biāo)有熒光基團的底物鏈從酶鏈脫離，同時與標(biāo)有猝滅基團的序列分離，熒光基團重新發(fā)出熒光，熒光倍數(shù)為猝滅時的3-4倍，該種熒光的激發(fā)光波長為560 nm，發(fā)射波長為580 nm。測試結(jié)果表明該種DNA傳感器的檢出限為10-8mol/L。此后，另一種鉛離子GR-5 DNAzyme也被應(yīng)用于熒光定量檢測技術(shù)并顯示出更好的選擇性（圖2-B）。

3.3 線性雙標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

為了提高線性標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量生物傳感器的相關(guān)性能，研究者引入一個以上的淬滅基團建立了線性雙標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測系統(tǒng)，以增加傳感器的猝滅效率，降低檢測系統(tǒng)的熒光背景值。Lan等［38］針對鉛離子檢測，設(shè)計了一種雙標(biāo)記功能核酸FAM熒光傳感器，其設(shè)計了一條5′ 端以共價鍵形式標(biāo)有FAM熒光基團的含20個堿基的8-17DNAzyme底物鏈與一條3′ 端標(biāo)有Dabcyl猝滅基團的含有34個堿基的8-17 DNAzyme酶鏈，并且在底物鏈的3′端加標(biāo)了一個猝滅基團，以降低底物鏈未切割時的熒光背景值。該實驗的實驗條件為pH為 7.2的50 mmol/L HEPES的緩沖液，其原理與線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)相似，最適檢測溫度為15-25℃，檢出限為10-8mol/L（圖2-C）。

4 熒光標(biāo)記型非線性功能核酸探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測技術(shù)是基于標(biāo)記熒光基團或猝滅基團的非線性單鏈核酸探針，與熒光標(biāo)記型線性功能核酸介導(dǎo)的技術(shù)的主要區(qū)別在于體系內(nèi)核酸結(jié)構(gòu)的不同，呈發(fā)卡型、蝎子型等非線性形狀。其原理同樣是在靶標(biāo)物質(zhì)的介導(dǎo)下，核酸探針的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起熒光基團與核酸探針或者熒光基團與猝滅基團間距離、狀態(tài)的變化，再導(dǎo)致熒光信號的改變，通過檢測這種熒光信號的變化定量檢測靶標(biāo)物質(zhì)。該類熒光定量檢測技術(shù)包括Scorpions primer探針介導(dǎo)型、Amplifluor primer（引物特異型）探針介導(dǎo)型與Hairpin Probe（發(fā)卡探針型）介導(dǎo)型等典型類型。

4.1 Scorpions primer（蝎子引物型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

Scorpions primer是一種在5′端標(biāo)記有一段防止5′端延伸的核酸尾鏈的引物探針，這種探針可以與經(jīng)過引物探針尾部延伸的同體分子靶序列互補配對，因為探針—靶物質(zhì)的結(jié)合對二次退火和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)的支持，這種分子內(nèi)部結(jié)合的速度縮短了反應(yīng)過程中的平衡時間，使得信號技術(shù)十分滿足快速檢測的要求。Whitcombe等［39］利用這種蝎子型自擴增探針檢測了PCR產(chǎn)物，同樣，這種探針包含了由50個左右堿基，5′延伸部分，熒光猝滅分子對，以及一段自互補莖序列組成，這種蝎子型探針比普通探針與靶DNA結(jié)合的更快更穩(wěn)定。在檢測時，將體系加入到實時普通PCR體系中，每輪擴增過程后，在靶物質(zhì)存在時，熒光探針可與再次退火的熱變性模版競爭結(jié)合，每次退火過程后進行熒光強度的讀數(shù)，達到熒光實時定量檢測的目的。

4.2 Amplifluor primer（引物特異型）探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

Uehara等［40］介紹了一種基于引物特異型探針的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理針對端粒酶閉管型檢測方法。該引物特異型探針包含了3′端和端粒重復(fù)靶序列互補配對的序列，5′端一個標(biāo)有熒光基團和猝滅基團的發(fā)卡狀的41 nt長的核酸序列，發(fā)卡結(jié)構(gòu)與端粒酶重復(fù)序列沒有同源部分，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該實驗通過檢測端粒酶重復(fù)序列對端粒酶活性進行檢測，檢測時，在端粒酶具有活性時，隨著端粒酶的加入，底物序列的3′端開始30℃延伸端粒酶重復(fù)序列30 min，接著加入引物特異型序列，進行30 輪的94℃熱變性30 s和59℃的30 s PCR擴增過程，當(dāng)其與端粒酶重復(fù)序列互補的序列段與端粒酶重復(fù)序列結(jié)合時，其發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，熒光基團與猝滅基團被分離，發(fā)射熒光；當(dāng)端粒酶序列不存在時，引物特異性探針內(nèi)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)保持發(fā)卡狀態(tài)，熒光基團與猝滅基團發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光被猝滅，通過對后續(xù)PCR擴增循環(huán)過程的熒光強度的監(jiān)測實現(xiàn)對端粒酶實時監(jiān)測的目標(biāo)（圖2-D）。

4.3 Hairpin Probe（發(fā)卡探針型）介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

為了提高標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量生物傳感器的相關(guān)性能，研究者將檢測系統(tǒng)中用到的功能核酸的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，加強底物鏈與酶鏈之間的結(jié)合率，降低檢測時的背景值。Wang和Nagraj等［41-42］將8-17 DNAzyme 酶鏈與底物鏈設(shè)計成一條發(fā)卡狀核酸鏈以加強其結(jié)合率，Wang等同時將FAM熒光基團與猝滅基團標(biāo)記于核酸鏈的兩端，該段探針包含60左右個堿基，其中包含10個連續(xù)的胸腺嘧啶，檢測條件為pH為 7.2的50 mmol/L HEPES緩沖液與100 mmol/L NaCl溶液，其原理與線性單標(biāo)記探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)相似，該傳感器的檢測限可達到2 nmol/L（圖 2-E，2-F）。

5 熒光標(biāo)記型功能核酸雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

這類核酸鏈標(biāo)記型功能核酸熒光定量檢測技術(shù)是基于標(biāo)記熒光基團或猝滅基團的功能核酸雙探針，該種熒光標(biāo)記型功能核酸雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)最大的特點是在該體系中含有兩條熒光基團或者猝滅基團標(biāo)記的功能核酸探針，其原理是在靶標(biāo)物質(zhì)的介導(dǎo)下，兩條核酸探針的相對狀態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起熒光基團與核酸或者熒光基團與猝滅基團間距離、狀態(tài)的變化，再導(dǎo)致熒光信號的變化，通過檢測這種熒光信號的變化定量檢測靶標(biāo)物質(zhì)，該類熒光定量檢測技術(shù)包括猝滅型雙探針介導(dǎo)型、熒光共振能量轉(zhuǎn)移型雙探針介導(dǎo)型等典型類型。

5.1 猝滅型雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

猝滅型雙探針（Binary probe）介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)含有兩條單標(biāo)記探針，基于熒光猝滅原理，兩條探針設(shè)計時可以在特定結(jié)合位點與靶序列互補配對或與靶序列進行競爭結(jié)合，當(dāng)靶信號存在時，兩探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光信號相關(guān)物質(zhì)可以發(fā)生熒光產(chǎn)生，熒光猝滅，熒光波長改變等熒光信號的變化，達到檢測目的。Heller 等［43］設(shè)計了一種雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)，他們利用兩條分別在3′端和5′端標(biāo)記熒光基團和猝滅基團的可與靶序列互補配對的探針，當(dāng)其與擴增后的靶序列結(jié)合時，兩段探針上的熒光基團和猝滅基團足夠靠近，發(fā)生熒光猝滅，產(chǎn)生熒光信號。該探針在10個堿基至10 000個堿基的區(qū)間都可以實現(xiàn)結(jié)合，當(dāng)堿基數(shù)少于10個時，探針結(jié)合不穩(wěn)定，在低于20℃時會發(fā)生解離，當(dāng)堿基數(shù)大于10 000個時，結(jié)合過程時間過長（圖2-G）。

5.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移型雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移型雙探針介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，兩條探針設(shè)計時一條上邊進行能量供體標(biāo)記，一條進行能量受體標(biāo)記，可以在特定結(jié)合位點與靶序列互補配對或與靶序列進行競爭結(jié)合，檢測機理與上述猝滅型相似。在理想的雙探針檢測中，供體的激發(fā)光僅僅可以在靶標(biāo)物質(zhì)不存在時候激發(fā)供體發(fā)熒光，在靶標(biāo)物質(zhì)存在時，供體不發(fā)熒光僅受體發(fā)熒光，但也由于激發(fā)光的直接激發(fā)，使得該系統(tǒng)熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率降低了信號/背景熒光比例，而這一問題被由Marti等［44］報道的三熒光基團探針系統(tǒng)有效解決，這一系統(tǒng)基于FAM-TAMRA-Cy5熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理對mRNA進行檢測，這3種熒光物質(zhì)的發(fā)射檢測波長分別為518 nm、581 nm和667 nm，該系統(tǒng)中一條探針標(biāo)記著被4個堿基對隔開的FAM和TAMRA基團，第二條被 Cy5所標(biāo)記，在靶標(biāo)DNA存在時，F(xiàn)AM能且僅能與TAMRA發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)探針與靶標(biāo)DNA結(jié)合時，TAMRA可與Cy5發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，結(jié)果導(dǎo)致產(chǎn)生Cy5的熒光產(chǎn)生以及TAMRA熒光的減少，這種原理可以有效地提高信號/背景熒光比值（圖2-H）。

6 總結(jié)與展望

功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)是一種具有高靈敏度，高特異性，甚至具有實時特性的分子檢測技術(shù)，目前在食品、臨床、環(huán)境多種檢測檢測領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用意義。但是，現(xiàn)階段仍存在一些局限性問題，如在熒光物質(zhì)標(biāo)記方面，部分標(biāo)記型熒光物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)僅局限在特定堿基上，無法進行多種堿基的檢測與標(biāo)記；有一部分具有優(yōu)良發(fā)光、猝滅熒光性質(zhì)的熒光物質(zhì)在功能核酸上的標(biāo)記技術(shù)不夠成熟，仍停留在實驗室研究，未進入產(chǎn)業(yè)化階段。在標(biāo)記型熒光核酸傳感策略的設(shè)計方面，部分傳感策略對熒光物質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)變化的要求較為嚴格，只能實現(xiàn)在特定環(huán)境中對特定物質(zhì)的檢測，無法實現(xiàn)通用型檢測；傳感性能還有待優(yōu)化和完善，如熒光背景值過高、重復(fù)性不夠強、檢測時間過長等問題。因此，需要針對熒光物質(zhì)、熒光傳感思路、熒光性能優(yōu)化等方面進一步探索和思考，如通過對相關(guān)物質(zhì)發(fā)光機制、結(jié)構(gòu)特性等方面的探究，開發(fā)、合成性能更佳的熒光物質(zhì)。同時，結(jié)合物質(zhì)發(fā)光特點更巧妙地設(shè)計在標(biāo)記型熒光傳感系統(tǒng)中，并優(yōu)化熒光物質(zhì)與功能核酸的標(biāo)記方式，使其結(jié)合程度更符合我們實驗的要求；針對功能核酸標(biāo)記型熒光傳感設(shè)計時，可以考慮檢測靶標(biāo)物質(zhì)的通用性，將原來一種熒光傳感策略設(shè)計成一類或多類的通用型傳感策略。另外，開發(fā)更高靈敏度，重復(fù)性更好的高通量實時傳感技術(shù)也是功能核酸熒光標(biāo)記型定量統(tǒng)一化檢測技術(shù)的重要研究方向。

圖2 熒光標(biāo)記型功能核酸介導(dǎo)的熒光定量檢測技術(shù)原理圖