VEGF-A、VEGF-C在口腔疣狀癌和口腔鱗狀細胞癌中的表達

陳 芬，郭凌燕，李 羽，陳林林

(南昌大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科、江西省口腔生物醫(yī)學重點實驗室，南昌 330006)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，其易發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移，預后相對較差[1]?？谇火酄畎?oral verrucous carcinoma，OVC)是鱗狀細胞癌的疣狀變異型，生長方式為局部推進，生長緩慢，轉移發(fā)生在后期或不轉移，預后相對較好。OSCC與OVC呈現(xiàn)出的不同臨床和顯微病理特征反映出其不同的生物學行為和預后。

以往學者做了大量的研究,以明確參與OVC發(fā)病機制的活性分子。MOHTASHAM等[2]對p53、Ki-67、MMP-2、MMP-9進行了組織化學分析,發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以在腫瘤侵襲前期用于鑒別OSCC和OVC。Bcl-X和細胞周期蛋白D1也被發(fā)現(xiàn)在OVC中有差異表達[3-4]。HARISHANKAR等[5]發(fā)現(xiàn)Notch4下調可作為OVC可靠的預后標記,但是在腫瘤細胞增殖活性的研究上，VALLONTHAIEL等[6]發(fā)現(xiàn)pRb、p16和p27蛋白在OSCC和OVC之間沒有明顯區(qū)別。導致兩者明顯不同的生物學行為的相關病理因素仍然不完全清楚。本研究基于OSCC和OVC兩者的臨床病理特征不同，比較評價血管內皮生長因子A(VEGF-A)和血管內皮生長因子C(VEGF-C)在OSCC和OVC中的表達，以探討OSCC和OVC不同臨床生物學特征可能的內在原因。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集南昌大學附屬口腔醫(yī)院2005—2013年經手術切除并經病理診斷確診為口腔疣狀癌26例(OVC組，發(fā)生于下唇12例、牙齦6例、頰黏膜3例、口底2例、舌2例、磨牙后區(qū)1例)、口腔鱗狀細胞癌21例(OSCC組，發(fā)生于牙齦9例、頰黏膜8例、口底2例、舌1例、磨牙后區(qū)1例)組織標本以及6例正常口腔牙槽黏膜(對照組)組織標本。根據口腔癌的國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版TNM分類分期方法對病例進行臨床分期，其中口腔疣狀癌Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期4例；口腔鱗癌Ⅰ期8例，Ⅱ期8例，Ⅲ期5例。口腔疣狀癌無淋巴結轉移病例，口腔鱗癌的5例Ⅲ期病例均為頸淋巴轉移。排除標準：發(fā)生于口腔外其他部位的疣狀癌和鱗癌，病史不詳?shù)幕颊撸中g前接受過放療、化療或其他治療的患者。每個蠟塊行3 μm厚連續(xù)切片5張。本研究已獲得南昌大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會同意和患者知情同意。

1.2 試劑與材料

即用型VEGF-A兔抗人多克隆抗體(4 μg·mL-1)、VEGF-C鼠抗人單克隆抗體(4 μg·mL-1)，均購自SantaCruzBiotechnology公司；快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(KIT-5030)，DAB顯色試劑盒(DAB-0031),免疫組化防脫片劑多聚賴氨酸(GLU-0040)均購自福州邁新生物技術有限公司。無水乙醇、二甲苯、中性樹膠等為國產市售產品。

1.3 免疫組織化學檢測

蠟塊常規(guī)切片(厚3 μm)采用MaxvisionTM2/HRP法對組織切片進行VEGF-A、VEGF-C免疫組化染色。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，選用VEGF-A和VEGF-C高表達的乳腺癌腫瘤細胞作為陽性對照。

1.4 結果判定

由兩位有經驗的病理科醫(yī)生采用統(tǒng)一評分標準和單盲法對所有染色結果進行判定，評分過程均重復2次以上。觀察者事先不知道所觀察切片的任何臨床信息。

VEGF-A、VEGF-C陽性判定標準:細胞陽性表達所占百分率為0%、1%～10%、11%～30%、31%～50%、51%～100%，分別計作0、1、2、3、4分；根據腫瘤細胞與間質細胞的著色深淺對比，來判斷染色強度，無著色為0分、輕度著色為1分、中度著色為2分、重度著色為3分。將兩項得分相加，定為染色結果，若總分≥3，則認為VEGF-A或VEGF-C陽性[7]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF-A表達比較

VEGF-A蛋白主要位于細胞漿內,陽性著色為棕黃色或棕褐色,也可見細胞膜著色,腫瘤邊緣著色更深(封三圖1A—C)。OSCC組VEGF-A表達陽性率明顯高于OVC組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 VEGF-A在3組組織中的表達比較 例

#P<0.05與OSCC組比較。

2.2 VEGF-C表達比較

VEGF-C蛋白主要位于細胞漿內,陽性著色呈棕黃色或棕褐色(封三圖1D—E)。OSCC組VEGF-C表達陽性率均明顯高于OVC組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 VEGF-C在3組組織中的表達比較 例

#P<0.05與OSCC組比較。

3 討論

口腔疣狀癌是鱗狀細胞癌的疣狀變異型，生長方式為局部推進，生長緩慢，后期發(fā)生轉移或不轉移，預后相對較好。隨著對口腔疣狀癌的進一步研究，發(fā)現(xiàn)其生物學行為具有多樣性，唐瞻貴等[8]將口腔疣狀癌分為外生型、浸潤型和囊腫型，并發(fā)現(xiàn)口腔角化囊性瘤、口腔疣狀白斑和口腔扁平苔蘚可惡變發(fā)展為口腔疣狀癌。有少部分口腔疣狀癌發(fā)展迅速，甚至早期發(fā)生淋巴結轉移，因此，研究口腔疣狀癌與口腔鱗狀細胞癌不同的發(fā)生發(fā)展機制，對臨床上口腔疣狀癌患者選擇更合適的治療手段具有重要意義。

盡管目前大多數(shù)學者認為VEGF-A、VEGF-C與惡性腫瘤的脈管新生關系密切，但在各類腫瘤的研究中，兩者與腫瘤局部生長、局部淋巴結轉移或遠處器官轉移之間關系的研究結果還是存在著差異[9-11]。

腫瘤患者體內存在多種血管生成刺激因子,在眾多血管生成刺激因子中，VEGF被認為是最重要的始動因子。1989年,FERRARA等[12]首次從牛腦垂體濾泡星狀細胞體外培養(yǎng)液中將VEGF-A純化出來，研究證明,VEGF-A在增加微血管滲透性的同時，還能使內皮細胞發(fā)生有絲分裂，從而促進內皮細胞增殖，形成新生微血管，因此，VEGF-A的表達水平可以反應組織血管生成的能力。

與血管內皮生長因子相結合的受體是特異性酪氨酸蛋白激酵受體(receptor tyrosine kinase,RTK)超家族,即受體VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。其中VEGFR-1、VEGFR-2位于血管內皮表面，VEGFR-3位于淋巴管內皮表面，VEGF-A主要與VEGFR-1、VEGFR-2相結合，作用于血管內皮，主要誘導血管生成。VEGF-C與VEGFR-2、VEGFR-3相結合，但其與VEGFR-3相結合的親和力比VEGFR-2高3倍多，優(yōu)先與VEGFR-3相結合，所以VEGF-C的主要作用是誘導淋巴管生成[13-15]。

有研究[16-17]表明在多種腫瘤中VEGF都有高表達，如肺癌、胃癌、食道癌、喉癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌及膀胱癌。YANASE等[18]的研究發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細胞癌中，VEGF-A表達與淋巴結轉移顯著相關，VEGF-C與淋巴結轉移、復發(fā)、5年生存率相關。本研究結果表明,在口腔疣狀癌組織中VEGF-A陽性表達率為42.31%(11/26),VEGF-C陽性表達率為11.54%(3/26)；口腔鱗狀細胞癌組織中VEGF-A陽性表達率為71.43%(15/21),VEGF-C陽性表達率為52.38%(11/21)；而在正?？谇火つそM織中VEGF-A低表達，陽性表達率為16.67%(1/6)，VEGF-C無表達。VEGF-A及VEGF-C在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達明顯高于口腔疣狀癌組織和正?？谇火つそM織，提示VEGF-A及VEGF-C的高表達可能是促進口腔鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素，可能影響其生物學行為及其轉移潛能，導致口腔鱗狀細胞癌較口腔疣狀癌更易發(fā)生局部復發(fā)及區(qū)域性淋巴結轉移。