高原地區(qū)妊娠期高血壓產(chǎn)婦胎盤Stat3、Survivin及MMP-2的表達(dá)水平及意義

李宗英，趙得熊，張海燕，郝麗娟

（青海紅十字醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科，2.耳鼻喉科，青海 西寧 810000）

妊娠期高血壓疾病是女性妊娠期的常見并發(fā)癥，近年來發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，且高原地區(qū)發(fā)病率高于平原地區(qū)[1-2]。關(guān)于妊娠期高血壓疾病的發(fā)生機(jī)制尚未有統(tǒng)一定論。有研究證實(shí)胎盤中滋養(yǎng)細(xì)胞參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生，胎盤組織中信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3, Stat3）、Survivin及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）與滋養(yǎng)細(xì)胞能力下降密切相關(guān)[3-4]。本研究檢測高原地區(qū)妊娠期高血壓患者胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2的表達(dá)，以探究高原環(huán)境中妊娠期高血壓疾病的發(fā)生與3者的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月—2017年4月在青海紅十字醫(yī)院行分娩的79例產(chǎn)婦作為研究對象。將產(chǎn)婦分為輕中度組、重度組和正常組，分別為30、27和22例。其中，輕中度組產(chǎn)婦年齡19～38歲，平均（28.64±3.21）歲；分娩孕周38～40周，平均（39.69±2.34）周。重度組產(chǎn)婦年齡20～39歲，平均（29.13±3.54）歲；分娩孕周39～40周，平均（39.09±2.16）周。正常組產(chǎn)婦年齡22～39歲，平均（27.86±2.67）歲；分娩孕周38～40周，平均（39.73±3.06）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①高血壓、心腦血管及糖尿病病史；②心、肝、腎及免疫系統(tǒng)存在嚴(yán)重缺陷；③出現(xiàn)胎膜早破、前置胎盤及胎兒窘迫等異常情況。研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集產(chǎn)婦分娩后在無菌環(huán)境中剪取臍帶根部面積約0.5 m2的胎盤組織，生理鹽水漂洗后用紗布吸干水分，一部分放入-80℃冰箱中保存，另一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.2 胎盤組織蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色常規(guī)制備胎盤組織石蠟切片，脫水后進(jìn)行蘇木精復(fù)染，浸入1%鹽酸5 s后水洗，加入伊紅染液染色脫水，滴加二甲苯進(jìn)行透明處理，用中性樹脂進(jìn)行封片，將切片放置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）從冰箱中取出保存胎盤組織，采用RNA提取試劑盒提取組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：10×cDNA模板1μl，正反向引物各0.5μl，H2O 8μl，10μl 2×SYBR Mix。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。運(yùn)用CFX manager 3.0軟件以β-actin作為內(nèi)參基因按照2-ΔΔCt法進(jìn)行基因相對定量分析。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法胎盤組織石蠟切片脫水后置于檸檬酸鹽緩沖液中20 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）清洗后，加入3%過氧化氫溶液放置25 min。PBS清洗后，滴加山羊血清反應(yīng)15 min，加Stat3、Survivin及MMP-2一抗置于4℃冰箱中過夜。PBS清洗后加入二抗，室溫下孵育20 min后加入DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。水洗后，進(jìn)行蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中5 s后清洗，脫水后滴加二甲苯進(jìn)行透明處理，用中性樹脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。每張切片挑選10個(gè)視野，計(jì)算陽性染色細(xì)胞數(shù)比例，當(dāng)比例＜5%細(xì)胞總數(shù)為陰性，比例介于5%～100%為 陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用χ2分割法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.0125，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胎盤組織HE染色結(jié)果

正常組胎盤組織中絨毛血管數(shù)量較多且體積小，血管壁均未見異常。輕中度組胎盤中絨毛數(shù)量有所下降，且滋養(yǎng)細(xì)胞增多形成結(jié)節(jié)，宮腔變窄，管壁周圍出現(xiàn)纖維狀壞死。而重度組情況更為嚴(yán)重。見圖1。

2.2 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較

各組Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，輕中度組各指標(biāo)均較正常組下降（P ＜0.05），重度組各指標(biāo)均較輕中度組下降（P ＜0.05）。見表1和圖2。

圖1 各組胎盤組織染色結(jié)果 （HE×100）

表1 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較 （±s）

表1 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA水平比較 （±s）

組別nStat3SurvivinMMP-2正常組220.85±0.080.89±0.070.81±0.05輕中度組300.72±0.040.74±0.030.68±0.03重度組270.63±0.010.57±0.030.59±0.02 F值121.865312.736251.124 P值0.0000.0000.000

圖2 各組胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2 mRNA 水平比較 （±s）

2.3 各組胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白陽性率比較

Stat3、Survivin及MMP-2陽性細(xì)胞主要分布于胞漿中，呈棕黃色。各組Stat3、Survivin及MMP-2蛋白陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；輕中度組各指標(biāo)陽性率均較正常組下降（P ＜0.05），重度組各指標(biāo)陽性率均較輕中度組下降（P ＜0.05）。見表2和圖3。

2.4 各組胎盤和新生兒資料比較

各組胎盤重量、新生兒身高及體重比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)，輕中度組各指標(biāo)均較正常組下降（P ＜0.05），重度組各指標(biāo)均較輕中度組下降（P ＜0.05）。見表3。

表2 各組胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白陽性率比較 例（%）

圖3 各組胎盤組織中Stat3、Survivin及MMP-2蛋白表達(dá)情況 （×100）

2.5 Stat3、Survivin、MMP-2的相關(guān)性分析

Stat3、Survivin及MMP-2相互間及其與胎盤重量、新生兒體重均呈正相關(guān)（P ＜0.05）。Survivin與身高呈正相關(guān)（P ＜0.05）。見表4。

表3 各組胎盤和新生兒資料比較 （±s）

表3 各組胎盤和新生兒資料比較 （±s）

組別n胎盤重量/kg新生兒身高/cm新生兒體重/kg正常組220.53±0.1152.24±1.683.14±0.51輕中度組300.46±0.0651.16±2.062.47±0.48重度組270.39±0.0450.13±1.471.91±0.34 F值22.6578.61946.006 P值0.0000.0030.000

表4 Stat3、Survivin、MMP-2的相關(guān)性分析

3 討論

高原地區(qū)海拔一般＞3 000 m，氣候惡劣，紫外線輻射強(qiáng)，高寒缺氧，體內(nèi)供氧和耗氧常失衡，導(dǎo)致一系列的病理生理改變，例如對血液流變學(xué)及血管收縮產(chǎn)生較大的影響，血液易發(fā)生濃縮現(xiàn)象且血容量明顯降低，這些因素均為妊娠期高血壓疾病的發(fā)生提供條件[6]。本研究通過檢測高原地區(qū)產(chǎn)婦胎盤中Stat3、Survivin及MMP-2的表達(dá)，試圖闡明在高原環(huán)境中3者的表達(dá)與妊娠期高血壓疾病發(fā)生的聯(lián)系。

胎盤病變在妊娠期高血壓疾病的發(fā)生中起重要作用，有學(xué)者認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生異常是胎盤病變的前提[7]。本研究顯示盤中絨毛數(shù)量下降，且滋養(yǎng)細(xì)胞增多形成結(jié)節(jié)，血管發(fā)育不良，重度組情況更為嚴(yán)重，分析原因可能為母體發(fā)生病變的情況下滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮的侵襲能力下降，導(dǎo)致子宮螺旋動脈功能重塑受阻，血管變窄，絨毛間隙狹窄，進(jìn)而加重病情[8]。本研究結(jié)果顯示，妊娠期高血壓疾病患者M(jìn)MP-2 mRNA、陽性表達(dá)低于正常分娩者，隨著病情程度的增加陽性表達(dá)率逐漸降低，可能是MMP-2在滋養(yǎng)細(xì)胞中含量下降，使浸潤能力受影響，導(dǎo)致絨毛發(fā)育不良胎盤病變。細(xì)胞外基質(zhì)降解在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有研究發(fā)現(xiàn)MMP-2等基質(zhì)金屬蛋白酶參與此過程，能夠分解膠原、凝膠、黏連蛋白等，且妊娠期高血壓疾病者M(jìn)MP-2蛋白表達(dá)低于正常妊娠者[9]。本研究結(jié)果與以上研究相符合，提示MMP-2與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生相關(guān)。

Survivin屬于細(xì)胞凋亡抑制因子，在胚胎、胎兒組織中高度表達(dá)。Stat3是Stat蛋白家族成員，能夠通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對凋亡相關(guān)因子進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、凋亡。相關(guān)研究顯示Survivin在整個(gè)妊娠過程中均有表達(dá)，且Survivin在妊娠期高血壓疾病患者中水平低于正常者[10]。Stat3水平升高能夠激活抑癌基因P21以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡、促增殖的作用[11]。本研究顯示妊娠期高血壓疾病患者胎盤中Survivin、Stat3陽性表達(dá)率低于正常分娩者，隨著病情程度的增加其表達(dá)水平逐漸降低。有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中Survivin表達(dá)下降導(dǎo)致細(xì)胞過渡凋亡，從而降低胎盤功能，Stat3蛋白表達(dá)降低能夠抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[12-13]。以上研究表明Survivin、Stat3蛋白與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生、病情進(jìn)展相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)Stat3、Survivin及MMP-2相互間呈正相關(guān)，且3者與胎盤重量、新生兒體重呈正相關(guān)，說明Stat3、Survivin、MMP-2的表達(dá)與胎盤以及胎兒的生長、發(fā)育密切相關(guān)，可以根據(jù)3者蛋白表達(dá)對患者病情程度及新生兒預(yù)后進(jìn)行評估。

綜上所述，Stat3、Survivin及MMP-2蛋白與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生密切相關(guān)，且與病情嚴(yán)重程度及新生兒預(yù)后相關(guān)，為妊娠期高血壓疾病的治療提供一定的參考，但本研究僅從組織學(xué)方面進(jìn)行檢測，其具體生理機(jī)制及分子機(jī)制還需后續(xù)深入研究。