芪術(shù)顆粒對肝纖維化大鼠肝竇內(nèi)皮細胞整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號通路的影響*

張 榮 劉紹能 馬繼征 丁佳媛 劉慧敏 張 玲 路迎冬

中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 (北京， 100053)

肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷的共同反應，是各種慢性肝病共同病理過程。盡管經(jīng)過多年的研究，有效和安全地終止或逆轉(zhuǎn)纖維化的治療仍處于摸索階段。芪術(shù)顆粒在肝纖維化治療中取得一定療效，然而肝纖維化的發(fā)生機制中有多種細胞因子及多條細胞信號通路參與，其中整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑是肝纖維化激活的一條重要信號通路。本研究以芪術(shù)顆粒為研究對象，在明確其對肝纖維化有治療作用的基礎上[1,2]，從整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導通路探討芪術(shù)顆?？估w維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠70只，雄性，清潔Ⅱ級，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。本院II級動物房分籠飼養(yǎng)，飼以標準大鼠合成飼料，自由飲用大鼠專用無菌水，環(huán)境溫度(20±2)℃，相對濕度36%。

1.2 藥物與試劑 芪術(shù)顆粒：本院制劑室提供的中成藥(京藥制字Z20063189)，臨床用量6 g/次，2次/d，日總量12 g，動物與人每公斤體重劑量折算系數(shù)是6.25(參考施新猷主編《現(xiàn)代醫(yī)學實驗動物學》)，折算大鼠用藥量為1.25 g/kg/d。復方鱉甲軟肝片(國藥準字Z19991011，內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn))功效軟堅散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)血，用于慢性乙型肝炎肝纖維化以及早期肝硬化屬瘀血阻絡、氣血虧虛兼熱毒未盡證者，臨床用量2 g/次，3次/d，日總用量6 g，折算大鼠日用藥量為0.625 g/kg。四氯化碳(CCl4，分析純，北京化學試劑公司)，橄欖油(分析純，北京化學試劑公司)。臺盼藍染色試劑盒(Beyotime，C0011)；SE-1試劑(NOVUS，NB110-68095SS)；CD31試劑(Affinity，AF6191)；整合素ɑVβ3試劑(Abcam，ab52939)。

1.3 主要儀器 病理切片機(德國，LEICA)；臺式高速冷凍離心機(湘儀，TGL-16K)；電泳儀(君意，JY300C)；電泳槽(君意，JY-SPDT)；勻漿機(wiggens，D-130)；電轉(zhuǎn)芯(JUNYI，JY-ZY6)；電轉(zhuǎn)儀(六一，DYCP-40E)；酶標儀(EMAXPLUS，E113783)；全自動化學發(fā)光圖像分析儀(TANON，TANON-5200)；生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX71)；FACS流式細胞儀(美國BD公司，C6)；臨界點干燥儀(Quorum,K850)；離子濺射儀(IXRF,MSP-2S)；掃描電子顯微鏡(Hitachi,SU8010)。

1.4 實驗方法

1.4.1 制備藥物血清 雄性Wistar大鼠50只，分為芪術(shù)顆粒高、中、低劑量組、對照組和正常組，每組10只。芪術(shù)顆粒中劑量組(簡稱中劑量組)大鼠以1.25 g/kg劑量的芪術(shù)顆粒灌胃；芪術(shù)顆粒高劑量組(簡稱高劑量組)大鼠以2.5 g/kg劑量芪術(shù)顆粒灌胃；芪術(shù)顆粒低劑量組(簡稱低劑量組)大鼠以0.625 g/kg劑量芪術(shù)顆粒灌胃，對照組大鼠按0.625 g/kg劑量灌胃復方鱉甲軟肝片混懸液，均2次/d，連續(xù)5天，末次灌胃后1 h于超凈臺自心臟采血，收集的血液在4℃冰箱垂直靜置3 h，在4℃離心機離心3 000 rpm×30 min，后于超凈臺無菌條件下分離血清并于56℃水浴箱滅活30 min，滅活后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即制備成芪術(shù)顆粒高、中、低劑量組及對照組大鼠藥物血清。正常組大鼠用三蒸水灌胃大鼠，余處理均與上述4組相同，獲取不含藥物的血清。均室溫冷卻，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 肝纖維化大鼠模型構(gòu)建 另選雄性Wistar大鼠20只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機取14只用10%CCl4橄欖油溶液按3 ml/kg劑量腹腔注射而造模，2次/周。另6只大鼠不造模作為正常對照，兩種大鼠均每周稱體重1次，依體質(zhì)量調(diào)整造模大鼠給藥劑量，連續(xù)4周。然后從造模大鼠中隨機取2只處死，取肝臟行Masson染色，以驗證肝纖維化造模是否成功。造模成功后，分別原位分離造模和正常大鼠肝竇內(nèi)皮細胞(LSECs)。

1.4.3 原位分離大鼠LSECs 麻醉處死造模和正常大鼠，消毒皮膚后迅速打開腹腔，顯露門靜脈和下腔靜脈；用無菌30G針頭插入門靜脈，同時剪破下腔靜脈；用含有0.5 mol/L EDTA 并且不含Ca2+和Mg2+的HBSS 灌注10 min，速度5 ml/min，然后用含有0.02%Ⅳ型膠原酶并且含有Ca2+和Mg2+的HBSS 灌注10 min，速度5 ml/min。灌注結(jié)束后，小心取下肝臟轉(zhuǎn)移至含有5%血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，無菌鑷子撕開肝包膜，使肝實質(zhì)細胞、非實質(zhì)細胞流出。將收集到的細胞懸液50 g低速離心10 min，收集上清液，400 g離心10 min 收集沉淀，沉淀用DMEM 完全培養(yǎng)基重懸后小心滴加在含有50% percoll和25% percoll離心管中，900 g高速離心20 min(不帶剎車)后，在25% percoll和50% percoll之間可見明顯的非實質(zhì)細胞條帶，小心將其吸出經(jīng)DMEM完全培養(yǎng)基重懸后離心洗去殘余的percoll液，將非實質(zhì)細胞懸液加入24孔板并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，將未貼壁細胞懸液離心后用含有1%內(nèi)皮生長因子和含有5%血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(ECM)重懸后按照2×106/ml接種在鼠尾膠原包被的6孔板或96孔板中。在37℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分離出的LSECs經(jīng)臺盼藍染色及流式細胞術(shù)鑒定。

1.4.4 LSECs處理 正常大鼠LSECs添加不含藥物的血清(簡稱正常組)。肝纖維化大鼠LSECs分5種情況添加血清：①添加無藥物的血清(簡稱模型組)；②添加低劑量芪術(shù)顆粒藥物血清(簡稱低劑量組)；③添加中劑量芪術(shù)顆粒藥物血清(簡稱中劑量組)；④添加高劑量芪術(shù)顆粒血清(簡稱高劑量組)；⑤添加復方鱉甲軟肝片藥物血清(簡稱對照組)。血清添加量均為10%，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后換液，培養(yǎng)48h后進行相關指標檢測。

1.4.5 檢測指標與方法 Western blot檢測整合素αVβ3、磷酸化FAK、Ras、磷酸化MAPK蛋白表達。收集細胞用含有蛋白酶抑制劑的裂解液(50 mol/L Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0, 250 mol/L NaCl, 1% Triton-X100)進行裂解。蛋白裂解液濃度利用BCA法(Beyotime，P0011)進行測量。10 μg細胞裂解液與5×樣品緩沖液(15 g SDS, 15.6 ml 2 M Tris pH 6.8, 57.5 g glycerol, 16.6 ml b-mercaptoethanol)混合后，將樣品上樣至10%聚丙烯酰胺凝膠中，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Bio-Rad，No.162-0177)。用含0.1% Tween-20的4%脫脂牛奶進行封閉后，加入抗體，4 ℃孵育過夜。用含0.1% Tween-20的PBS溶液將膜洗3遍后，加入含0.1% Tween-20的4%脫脂牛奶以及HRP二抗(Abcam, ab6721)在室溫條件下孵育2h。取出膜，在膜上滴加ECL顯影液(Bio-Rad，No.170-5060)并放入GelDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad)進行拍照。ImageJ v1.8.0軟件進行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 6組LSECs 整合素蛋白αVβ3、FAK、p-FAK、Ras、MAPK、p-MARK表達情況 見圖1。與正常組相比，其他5組LSECs整合素ɑVβ3蛋白水平均顯著升高，MAPK、FAK蛋白磷酸化水平亦均升高。與模型組相比，對照組LSECs αVβ3蛋白水平有所下降，MAPK、FAK蛋白磷酸化表達明顯被抑制，芪術(shù)顆粒高、中、低劑量組LSECs整合素αVβ3蛋白表達與模型組比較均有下降，MAPK、FAK蛋白磷酸化表達明顯被抑制。

圖1 6組LSECs整合素αVβ3、FAK、Ras-MAPK蛋白表達圖

2.2 6組LSECs整合素αVβ3、磷酸化FAK蛋白表達 見表1。

表1 6組LSECs整合素αVβ3、FAK磷酸化表達比較

2.3 6組LSECs Ras、MAPK磷酸化蛋白表達情況 見表2

表2 6組LSECs Ras、MAPK磷酸化蛋白比較

3 討論

肝纖維化主要表現(xiàn)為肝組織中細胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解的動態(tài)機制失衡，最終導致ECM在肝內(nèi)病理性沉積。肝星狀細胞(HSC)是肝臟損傷后最主要的致纖維化細胞，在各種細胞因子的作用下，活化的HSC通過其自旁、分泌作用，不斷地轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)分子，而其降解減少，最終導致肝纖維化的發(fā)生[3]。HSC增殖及細胞表型轉(zhuǎn)化、ECM合成增多并沉積同時伴新生血管是進展性肝纖維化修復重建中突出的病理表現(xiàn)，在這過程中整合素發(fā)揮重要作用。

整合素是一類細胞黏附分子，主要介導細胞與ECM、細胞與細胞間的黏附和細胞內(nèi)外的信息傳遞，調(diào)節(jié)細胞增值、生長及分化等。整合素αVβ3是多種ECM的受體，主要傳遞與細胞增殖、分化、運動、分布、定居、生存或凋亡等有關的細胞信號。正常肝組織很少表達整合素αVβ3，但在HSC活化和血管新生時表達上調(diào)[4]。近來研究表明在細胞因子刺激下，整合素αVβ3表達上調(diào)即是實質(zhì)損傷后血管重建和疤痕修復反應中關鍵受體分子，也是HSC活化和血管新生的共同生物標志[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組LSECs整合素αVβ3表達明顯增加，這與文獻報道一致。整合素可通過激活與整合素胞質(zhì)相關的信號蛋白來啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[7]，黏著斑激酶(FAK)是一種重要的整合素相關酪氨酸激酶信號蛋白。FAK是由整合素和ECM相互作用引發(fā)的信號級聯(lián)所必需的[8]，與基質(zhì)結(jié)合可導致整合素聚類和酪氨酸397位點的FAK自磷酸化，激活的FAK可以結(jié)合并磷酸化其他下游信號分子，最終影響細胞行為。在肝纖維化過程中，LSECs中整合素水平增加，F(xiàn)AK是整合素信號通路中重要的細胞因子，通過調(diào)節(jié)下游Ras-MAPK途徑，參與血管生成[9]，且發(fā)揮促進纖維化的作用，其中藥物抑制FAK可起到抗纖維化治療作用[10]。本研究結(jié)果提示芪術(shù)顆?？垢卫w維化作用與它對整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號通路的調(diào)控有關。

在以往的臨床中，我們發(fā)現(xiàn)慢性肝病-肝纖維化-肝硬化這一動態(tài)過程與氣滯-入絡-血瘀動態(tài)變化非常相似，故可按絡脈理論認識肝纖維化[11,12]。由此提出肝纖維化的病機關鍵是在毒損肝絡的基礎上形成“毒瘀肝絡”。芪術(shù)顆粒由黃芪、莪術(shù)、白術(shù)、柴胡、茵陳、丹參、桃仁等藥物組成，方中黃芪有益氣補虛之功；莪術(shù)有破血行氣，消積止痛之功，取其破血之力以消散肝中之瘀結(jié)；白術(shù)健脾以助黃芪益氣；丹參、桃仁助莪術(shù)活血化瘀；茵陳等清熱利濕解毒；柴胡等疏肝解郁，理氣通絡。本方具有益氣健脾、化瘀通絡、利濕解毒之功效，有較好的抗肝纖維化的作用[1,2]。

我們前期研究證實芪術(shù)顆?？赏ㄟ^調(diào)控Angs/Tie-2 mRNA的表達減輕肝竇毛細血管化，影響肝纖維化的形成[13]。又有研究提示，Angs/Tie-2介導的整合素αVβ3信號通路在其中發(fā)揮著重要作用[14]。本研究結(jié)果提示，芪術(shù)顆粒藥物血清對LSECs整合素αVβ3及其下游的FAK-Ras/MAPK蛋白表達有下調(diào)作用，說明該藥減少微血管增生與其抑制LSECs整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號通路有關。