miRNA-221/222基因多態(tài)性及肝功能指標(biāo)與乙型肝炎病毒相關(guān)原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián)性研究*

韓豎霞 張平安 趙友云

1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 (湖北 武漢， 430060) 2.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科

乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)原發(fā)性肝癌(HBV-PHC)具有惡性程度高、發(fā)展速度快、治療困難、生存期短、死亡率極高的特點(diǎn)，是世界上第五位常見的腫瘤[1]。HBV感染后可出現(xiàn)不同的疾病轉(zhuǎn)歸，如隱匿性肝炎、急性肝炎、慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)或PHC[2]。微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類普遍存在于動植物體內(nèi)的非編碼、短序列的小分子RNA，許多研究發(fā)現(xiàn)，疾病的發(fā)生、發(fā)展不僅與基因的突變和重排有關(guān)，也與miRNAs的調(diào)控密切相關(guān)[3]。miRNA-221/222位于染色質(zhì)Xp11上，其中miRNA-221可以在所有組織中表達(dá)，已知其可靶向許多關(guān)鍵性腫瘤抑制位點(diǎn)。許多研究已證實(shí)miRNA-221/222在PHC的發(fā)生、發(fā)展的各個方面起重要作用[4]。但是，關(guān)于miRNA-221/222基因多態(tài)性與HBV-PHC的發(fā)生是否相關(guān)卻鮮有報告。本研究通過分析HBV感染后不同轉(zhuǎn)歸的患者中miRNA-221/222基因多態(tài)性及肝功能指標(biāo)的差異，評估m(xù)iRNA-221/222基因多態(tài)性及肝功能指標(biāo)在HBV-PHC的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 295例患者均為2015年1月至2017 年12月在該院住院的患者，其中HBV-PHC患者94例、LC患者104例、CHB患者97例。HBV-PHC組男72例，女22例，年齡30～81歲，平均54.45歲；CHB組男66例，女31例，年齡25～78歲，平均51.94歲；LC組男74例，女30例，年齡21～78歲，平均54.55歲。各組患者在性別和年齡方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn):依據(jù)2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)。LC的診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)，同時有臨床提示或組織學(xué)檢測存在肝硬化的證據(jù)；病因?qū)W明確的HBV感染的證據(jù)；通過病史或相應(yīng)的檢查予以明確或排除其他常見的能引起肝硬化的病因如HCV感染、酒精和藥物等。PHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2011年中國衛(wèi)生部醫(yī)政司修訂的PHC診療規(guī)范中的標(biāo)準(zhǔn)。①具有肝硬化以及HBV感染的證據(jù)。②典型的HCC影像學(xué)特征：a.如果肝臟占位腫塊直徑≥2cm，CT和MRI兩項(xiàng)影像學(xué)檢查中有一項(xiàng)顯示肝臟占位性病變具有上述肝癌特征；b.如果肝臟占位腫塊直徑為1～2cm，則需要CT和MRI兩項(xiàng)影像學(xué)檢查都顯示肝臟占位性病變具有上述肝癌特征，③血清甲胎蛋白(AFP)≥400 μg/L持續(xù)1個月或≥200 μg/L持續(xù)2個月，并能排除其他原因引起的AFP升高。臨床診斷為HCC，要求同時滿足以下條件中的①+②a兩項(xiàng)或者①+②b+③三項(xiàng)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 均排除合并其他嗜肝病毒感染的肝炎或合并HIV感染者；伴有心、腎、肺、血液、代謝及胃腸道嚴(yán)重原發(fā)病者;不能合作或精神病患者；孕婦或哺乳期婦女；過敏體質(zhì)或多種藥物過敏的患者。

1.4 肝功能指標(biāo)檢測 包括肝功能8項(xiàng)指標(biāo)(ALT、AST、 ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb)，由羅氏module P800全自動生化分析儀檢測。

1.5 基因組DNA的提取及miRNA-221/222基因分型 用基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司生產(chǎn))提取人類基因組DNA，用超微量核酸分析儀測定DNA含量，然后-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)人類miRNA-221/222基因rs2858061位點(diǎn)C/G和rs2858059位點(diǎn)C/T，采用Vector NTI 11.0軟件設(shè)計(jì)引物和MGB探針序列(見表1)，并同時標(biāo)記FAM和VIC熒光集團(tuán)作為基因分型標(biāo)記，合成引物及探針，利用雙重FQ-PCR技術(shù)同步檢測標(biāo)本中miRNA-221/222基因rs2858061位點(diǎn)C或G，rs2858059位點(diǎn)C或T。

表1 FQ-PCR的引物和探針序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對ALT、AST、 ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb數(shù)據(jù)分布進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布的檢測值采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25～P75)]描述。組間差異比較采用非參數(shù)Kruskal-WallisH及Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率(%)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者肝功能結(jié)果 見表2。3組患者8項(xiàng)結(jié)果比較經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中HBV-PHC組患者GGT、ALP和AST水平明顯高于CHB組和LC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但CHB組與LC組之間無差異(P>0.05)；3組間ALT和TP水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBV-PHC組TBil、DBil、Alb水平與LC組無顯著性差異(P>0.05)。

表2 肝功能指標(biāo)在3組患者間的比較 [M(P25～P75)]

2.2 miRNA-221/222基因多態(tài)性的分布情況 見表3。由表3可見，在miRNA-221基因rs2858061位點(diǎn)中，與CC基因型相比，CG基因型和GG基因型在HBV-PHC組、CHB組和LC組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；等位基因C和G的分布在3組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。miRNA-222基因rs2858059位點(diǎn)中，與TT型相比，CT基因型和CC基因型在HBV-PHC組、CHB組和LC組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；等位基因C和T的分布在3組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 miRNA-221/222基因多態(tài)性在3組患者間的分布比較 [n(%)]

3 討論

PHC發(fā)病原因尚不明確，許多研究顯示，HBV感染與肝癌的發(fā)生存在較強(qiáng)的相關(guān)性。雖然現(xiàn)代治療方式的應(yīng)用使得其臨床療效得到了顯著提升，但因其早期的檢出率和確診率較低，導(dǎo)致其死亡率依然居高不下[5，6]。 因此PHC的預(yù)防、診斷及治療受到各界關(guān)注，尋找其潛在的分子標(biāo)志物等相關(guān)的研究已成為熱點(diǎn)。

隨著檢測技術(shù)的改進(jìn)和檢測經(jīng)驗(yàn)積累，肝功能相關(guān)指標(biāo)檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性、敏感性及穩(wěn)定性均得到了顯著提升，應(yīng)用范圍也不斷拓展，已成為肝臟疾病診斷和治療的重要內(nèi)容[7]。目前臨床對于肝功能監(jiān)測常采用的指標(biāo)主要有ALT、AST、ALP、GGT、TBil、DBil、TP、Alb 8 種。本研究顯示，HBV-PHC組GGT、ALP和AST水平明顯高于CHB組和LC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CHB組與LC組之間無差異(P>0.05)；3組之間ALT和TP水平均有顯著性差異(P<0.05)。分析原因，PHC患者的肝功能會出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂，而ALT、AST是主要存在于肝細(xì)胞中的兩種酶，前者多存在于細(xì)胞漿內(nèi)，后者多存在于細(xì)胞漿內(nèi)的線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時，ALT被釋放后進(jìn)入血液中從而使其血中濃度出現(xiàn)升高，當(dāng)肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，線粒體受到損傷時，AST也會滲入血液中，而使其濃度升高。血清中的GGT主要來自肝膽組織，健康人血清中的 GGT 水平很低，而膽汁中的水平很高。當(dāng)肝細(xì)胞受到炎癥、腫瘤或膽汁淤積的刺激時，GGT的合成便增加，血清中的 GGT 水平會明顯升高。ALP在肝內(nèi)外梗阻性黃疸時一般會增高。研究中還發(fā)現(xiàn)，HBV-PHC組患者的TBil、DBil、Alb水平與LC組比較無顯著性差異(P>0.05)。TBil 和 DBil 可以判斷是否存在溶血及肝膽系統(tǒng)的功能狀態(tài)，普通肝病、膽囊炎、精神因素、膽囊結(jié)石等都可以造成膽紅素代謝障礙,從而引起膽紅素升高，在診斷原發(fā)性肝癌時無特異性，與許多研究一致。 因此，本研究顯示，GGT、ALP、AST、ALT、TP可以用于HBV-PHC與LC的鑒別診斷,其中ALT和TP還可以用于乙型肝炎肝硬化的早期鑒別。

miRNA是一種廣泛存在于真核生物中、大小為20～22個核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA。它在生物進(jìn)化的過程中呈現(xiàn)高度保守的特點(diǎn)，在細(xì)胞中具有時空特異性表達(dá)模式。雖然此類RNA不編碼蛋白，但是其通過與靶基因序列特異性相互作用，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平中調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)，以此參與生物的細(xì)胞增殖和凋亡、器官形成及生長發(fā)育調(diào)控等進(jìn)程[8，9]。隨著研究的深入，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，許多研究顯示多種miRNAs參與了PHC的形成、演進(jìn)以及轉(zhuǎn)移過程。miRNA-221/222位于染色質(zhì)Xp11，miRNA-221與miRNA-222擁有共同基因序列和靶基因，且能與目標(biāo)基因特定序列互補(bǔ)配對，此段核苷酸吻合度最為重要，與靶mRNA結(jié)合起重要作用。已有研究顯示miRNA-221/222與肝癌的發(fā)生密切相關(guān),與正常組織相比，PHC中有大量異常表達(dá)的 miRNAs[10，11]。SNP是在基因水平上由單個核苷酸的變異而引起的DNA序列的多態(tài)性，也是最常見的一種可遺傳的變異。越來越多的研究表明，miRNA相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(miRNA-SNP)可以通過影響miRNA的合成、與靶基因結(jié)合等方式參與基因功能的調(diào)節(jié),影響細(xì)胞的調(diào)控過程，對許多腫瘤細(xì)胞組織，如甲狀腺癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的表達(dá)有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，在腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重大作用,這也是目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[12～16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221基因rs2858061位點(diǎn)中，幾個基因型的分布在3組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。雖然本研究未證實(shí)miRNA-221/222基因多態(tài)性與HBV-PHC的發(fā)生有一定的相關(guān)性，但是由于研究病例的數(shù)量及人群的限制，可能會有一定的片面性。未來會加大其他病例的收集和分析研究,進(jìn)一步研究miRNA基因及其靶點(diǎn)的多態(tài)性與HBV-PHC的相關(guān)性,探索肝癌早期診斷的新標(biāo)志，并為肝癌的病因、治療和預(yù)后提供新的思路。