甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子萌發(fā)及抗旱性的影響

曾偉航，程碧真，彭燕，李州

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草學(xué)系，四川 成都 611130)

在全球變暖背景下，干旱等極端氣候事件發(fā)生明顯增加[1]，世界各地干旱受災(zāi)面積和頻次也呈逐步增加的趨勢[2]。在影響植物生長的諸多環(huán)境因子中，水分條件尤為重要，水是種子萌發(fā)必不可少的重要條件之一。干旱脅迫嚴(yán)重影響植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化，也顯著抑制種子的萌發(fā)[3]。干旱脅迫下，植物的生長和功能往往會受到抑制，使植物體發(fā)生氧化性損傷、代謝紊亂和DNA斷裂等，直至植物死亡[4]。付咪咪等[5]研究發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%～25%)的PEG會對黃秋葵(Abelmoschusesculentus)種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，且抑制作用會隨干旱脅迫程度的加深而顯著增強(qiáng)，當(dāng)干旱脅迫達(dá)到一定程度時(shí)(20% PEG)，黃秋葵種子的萌發(fā)會完全受到抑制，即不能萌發(fā)。Liu 等[6]研究發(fā)現(xiàn)干旱對小麥(Triticumaestivum)種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，15% PEG脅迫下6個(gè)品種的小麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽鞘和胚根長度及重量均顯著低于對照。胡曉艷等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，馬蹄金(Dichondrarepens)和結(jié)縷草(Zoysiajaponica)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢隨干旱脅迫強(qiáng)度的增加呈顯著下降趨勢?？梢姡煌参锓N子在萌發(fā)過程中對干旱脅迫的耐受性有所不同，研究不同種子萌發(fā)時(shí)對干旱脅迫的耐受性對發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)及指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要意義。

白三葉(Trifoliumrepens)又稱白車軸草，屬于豆科(Leguminosae)三葉草屬(Trifolium)，是我國長江以南廣泛栽培應(yīng)用的優(yōu)良豆科牧草之一，具有產(chǎn)量高、牧草品質(zhì)優(yōu)良、生物固氮能力強(qiáng)、為各種畜禽所喜食等優(yōu)點(diǎn)[8]。但白三葉喜冷涼濕潤氣候，適宜生長生態(tài)幅度較窄，耐旱性弱，因此干旱成為限制白三葉推廣栽培應(yīng)用的重要逆境因子。在眾多方法中，種子浸種預(yù)處理是提高作物種子萌發(fā)及抗逆性最簡單有效的方法。張艷等[9]研究表明，15% PEG脅迫顯著降低了白三葉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，但400 mg·L-1甜菜堿浸種后能明顯提高PEG干旱脅迫下白三葉種子的萌發(fā)，緩解干旱脅迫造成的傷害。本研究前期的試驗(yàn)也表明，30 μmol·L-1的亞精胺(spermidine,Spd)浸種預(yù)處理能顯著提高PEG干旱脅迫下白三葉種子的萌發(fā)，進(jìn)一步對相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在PEG脅迫下，Spd能促進(jìn)種子淀粉代謝及增強(qiáng)種子萌發(fā)過程中多種抗氧化酶活性，從而提高種子的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化防御[10]。

甘露糖(mannose，MAS)是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的單糖，為多種多糖的組成成分，常以游離狀態(tài)的形式存在于植物體中。已有研究表明，甘露糖與植物抗性密切相關(guān)。例如，Hameed等[11]研究表明在黃化小麥幼苗葉片中，1% MAS處理能提高小麥葉片的過氧化氫酶(catalase，CAT)活性、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性和抗壞血酸過氧化物酶(aseorbate peroxidase，APX)活性，延緩葉片衰老。He等[12]研究顯示，位于細(xì)胞質(zhì)中的DoGMP1蛋白催化GDP-甘露糖(guanosine diphosphate mannose,GDP-mannose)的合成，且DoGMP1轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)植株中MAS含量比野生型顯著增加。在鹽脅迫下，DoGMP1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子表現(xiàn)出較高的萌發(fā)和生長，DoGMP1可能通過上調(diào)水溶性糖和抗壞血酸(ascorbic acid，ASA)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累，從而提高鹽脅迫耐受性。Ai等[13]研究也發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫下，編碼GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMPase)的PpGMP轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)具有較高的耐鹽性和抗旱性、較高的種子萌發(fā)率、較好的生長性能、較高的ASA含量、更穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)、更高的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性和更低的丙二醛(malondialdehyde，MDA)及H2O2水平。但截至目前，有關(guān)MAS對干旱脅迫下白三葉種子萌發(fā)的影響報(bào)道甚少，MAS浸種是否能提高干旱脅迫下白三葉種子的萌發(fā)還有待研究。因此，本試驗(yàn)以生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的白三葉品種‘拉丁諾’(Ladino)為供試材料，研究不同濃度的MAS浸種對干旱脅迫下白三葉種子萌發(fā)的影響，篩選能提高干旱脅迫下白三葉種子萌發(fā)的最適MAS濃度，并進(jìn)一步從生理及分子水平揭示MAS誘導(dǎo)提高種子在干旱脅迫下萌發(fā)可能涉及的生理生化過程，旨在為提高白三葉種子萌發(fā)期抗逆性提供新方法，并為白三葉較好的栽培管理提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)以‘拉丁諾’白三葉(T.repenscv.‘Ladino’)為供試材料，于2017年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)工程試驗(yàn)室進(jìn)行，種子來源于四川百綠時(shí)代園林綠化有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)選取成熟健康的白三葉種子，經(jīng)0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min后用蒸餾水充分洗凈。消毒洗凈后的種子先用蒸餾水浸泡1 h。然后分成6組，分別浸泡在濃度為0(蒸餾水，對照)、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 mmol·L-1的甘露糖溶液中2 h。浸種過程均在避光條件下進(jìn)行。

取上述6組浸泡后的種子，每組分別置于0(對照)和18% PEG溶液潤濕的有雙層濾紙的潔凈培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)(每個(gè)培養(yǎng)皿中所加蒸餾水和18% PEG溶液等量)。試驗(yàn)共計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿放置50粒種子。為防止培養(yǎng)皿溶液干燥，每天將種子轉(zhuǎn)移到新的鋪有0或18% PEG潤濕的雙層濾紙的培養(yǎng)皿中(同上操作)。發(fā)芽試驗(yàn)均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，白天溫度23 ℃，夜晚溫度19 ℃，時(shí)長各為12 h，相對濕度70%。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1種子發(fā)芽測定 連續(xù)培養(yǎng)觀察7 d，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)，以胚根長度與白三葉種子等長視為發(fā)芽。

發(fā)芽率(%)=n/N×100

式中：n為發(fā)芽種子總數(shù)；N為供試種子總數(shù)。

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽3 d種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100

發(fā)芽指數(shù)GI=∑Gt/Dt

式中：Gt為發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)。

平均發(fā)芽時(shí)間=∑(D×n)/∑n

式中：D為從種子置床起計(jì)算的天數(shù)；n為相應(yīng)各天的發(fā)芽數(shù)。

種子發(fā)芽第7天時(shí)，將每一個(gè)處理隨機(jī)選取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取10株完整健全的幼苗用直尺測量胚芽長和胚根長。

1.3.2生理生化指標(biāo)測定 隨機(jī)選取成熟健康的白三葉種子，經(jīng)0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min后用蒸餾水充分洗凈。消毒洗凈后的種子先用蒸餾水浸泡1 h。然后分成2組，分別浸泡在濃度為0(蒸餾水，對照)或2.0 mmol·L-1的甘露糖溶液中2 h。浸種過程均在避光條件下進(jìn)行。將上述兩組處理過的種子分別置于0(對照)和18% PEG溶液潤濕的有雙層濾紙的潔凈大培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)(每個(gè)培養(yǎng)皿中所加蒸餾水和18% PEG溶液等量)。本試驗(yàn)共4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，分別為：1)處理1：CK(蒸餾水浸泡，蒸餾水發(fā)芽)；2)處理2：CK+MAS(2.0 mmol·L-1MAS浸泡，蒸餾水發(fā)芽)；3)處理3：PEG(蒸餾水浸泡，18% PEG發(fā)芽)；4)處理4：PEG+MAS(2.0 mmol·L-1MAS浸泡，18% PEG發(fā)芽)。

于發(fā)芽7 d時(shí)將已發(fā)芽的種子用蒸餾水迅速沖洗干凈，并用紙吸干表面水分，測定根系活力、電解質(zhì)滲透率(electrolytic leakage，EL)、MDA含量、SOD活性、CAT活性、POD活性、游離脯氨酸(free proline，Pro)、可溶性糖(soluble sugar，WSC)、淀粉(starch)、超氧陰離子(O2·-)產(chǎn)生速率、H2O2含量、淀粉酶活性等生理指標(biāo)。每個(gè)生理指標(biāo)均從每個(gè)重復(fù)中稱取0.1 g進(jìn)行測定。采用TTC還原法測定根系活力[14]； 采用常規(guī)的電導(dǎo)率儀法測定EL[15]；采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[16]； 采用核黃素-NBT法測定SOD活性[17]； 采用紫外吸收法測定CAT活性[18]； 采用愈創(chuàng)木酚顯色法POD[18]；采用茚三酮比色法測定Pro含量[14]；采用蒽酮乙酸乙酯比色法測定WSC和淀粉含量[14]； 參照郝建軍等[19]的方法測定O2·-產(chǎn)生速率；參照Uchida等[20]的方法測定H2O2含量；采用3，5-二硝基水楊酸法測定淀粉酶活性[21]。

1.3.3基因表達(dá)分析 試驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.3.2，從每個(gè)重復(fù)中稱取0.1 g籽苗凍存于液氮中，用于提取植物RNA。

采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測抗氧化酶基因表達(dá)，使用天根總RNA提取試劑盒提取白三葉籽苗總RNA,TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA第一鏈，利用TOYOBO熒光定量PCRmix進(jìn)行熒光定量PCR，PCR擴(kuò)增程序如下：在95 ℃ 變性5 min，在58 ℃(β-Actin，Cu/ZnSOD，F(xiàn)eSOD，CAT)或64 ℃(MnSOD，POD)退火45 s，40個(gè)循環(huán)，通過加熱從60到95 ℃的擴(kuò)增子以獲得熔解曲線?；蜣D(zhuǎn)錄水平的計(jì)算公式2-ΔΔCt采用Xia等[22]的計(jì)算方法。引物由華大基因公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列及其相應(yīng)基因庫序列號Table 1 Primer sequences and their corresponding GeneBank accession numbers of the analyzed genes

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)與作圖，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽特性及根系活力的影響

由表2可知，與蒸餾水浸種處理(CK)相比，干旱脅迫下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)明顯降低，平均發(fā)芽時(shí)間增長。而經(jīng)過0.5～5.0 mmol·L-1的甘露糖浸種能顯著(P<0.05)提高種子的發(fā)芽率。其中2.0 mmol·L-1浸種處理的上述發(fā)芽指標(biāo)均顯著好于其他處理。而當(dāng)甘露糖濃度達(dá)到10.0 mmol·L-1時(shí)，其各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均小于未經(jīng)甘露糖浸種的處理。由此可知，白三葉種子發(fā)芽過程中對干旱脅迫非常敏感，甘露糖浸種能在一定程度上促進(jìn)種子發(fā)芽，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的特點(diǎn)。經(jīng)篩選最適宜的甘露糖浸種濃度為2.0 mmol·L-1。

在根系長度和根系活力的變化上，與CK相比，CK+MAS處理的幼苗長明顯增加而根長沒有顯著差異(圖1A)。但在PEG脅迫下根長莖長均顯著降低，其中PEG+MAS的根長顯著高于PEG處理組，而莖長沒有明顯差異(圖1B，C)。甘露糖預(yù)處理也顯著提高了白三葉種子在PEG脅迫下發(fā)芽時(shí)的根系活力(圖1D)。

表2 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽的影響Table 2 Effect of the pretreatment of mannose on white clover seed germination under drought stress

注： 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different small letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level.

圖1 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽的莖長、根長和根系活力的影響Fig.1 Effect of the pretreatment of mannose on stem length, root length and root viability on white clover seed germination under drought stress 不同字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicated significant difference at P<0.05 level.The same below.

2.2 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽淀粉代謝及滲透調(diào)節(jié)的影響

從圖2A中可以看出，PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫顯著抑制了種子發(fā)芽過程中淀粉的分解，PEG處理組的種子淀粉含量顯著高于CK和PEG+MAS。正常條件下MAS浸種能顯著提高淀粉的分解。在PEG脅迫下，MAS浸種也能顯著緩解干旱脅迫導(dǎo)致的淀粉分解抑制，PEG+MAS的α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性和總淀粉酶活性均顯著高于其他處理組(圖2B～D)。

與CK相比，PEG脅迫下的白三葉種子發(fā)芽時(shí)的可溶性糖含量顯著增加，此時(shí)PEG和PEG+MAS處理組可溶性糖含量分別是CK和CK+MAS的2.5和2.2 倍，但PEG+MAS與PEG組的可溶性糖含量沒有顯著差異(圖3A)。同時(shí)，游離脯氨酸在PEG脅迫下也急劇升高，PEG+MAS上升幅度最大，顯著高于PEG處理組(圖3B)。而種子的滲透勢在PEG脅迫下急劇降低，PEG+MAS顯著低于PEG處理組(圖3C)。

圖2 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽淀粉及淀粉酶活性的影響Fig.2 Effect of the pretreatment of mannose on starch and amylase activity of white clover under drought stress

圖3 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽可溶性糖、游離脯氨酸和滲透勢的影響Fig.3 Effect of the pretreatment of mannose on soluble sugar content, free proline and osmotic potential of white clover under drought stress

2.3 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽氧化傷害及抗氧化防御的影響

從圖4可以看出，正常條件下甘露糖預(yù)處理對白三葉種子發(fā)芽時(shí)體內(nèi)的活性氧、丙二醛和電解質(zhì)滲透率沒有顯著影響，即低濃度的甘露糖浸種對白三葉種子發(fā)芽沒有顯著脅迫影響。與CK相比，PEG脅迫下種子的活性氧、丙二醛和電解質(zhì)滲透率均顯著提高，細(xì)胞氧化傷害程度加大。但PEG+MAS相對于PEG處理維持了顯著降低的超氧陰離子、過氧化氫、丙二醛和電解質(zhì)滲透率，降低的百分比分別為26.0%，25.9%，19.7%和16.1%。

從總抗氧化水平上看，PEG脅迫有效提高了種子發(fā)芽時(shí)總抗氧化能力，而PEG+MAS的總抗氧化能力比PEG處理高出15.0%，達(dá)到顯著水平(圖5A)。白三葉種子在PEG脅迫下的SOD和POD活性顯著降低，但PEG+MAS的SOD和POD活性顯著高于PEG(圖5B，C)。白三葉種子在PEG脅迫下的CAT活性顯著高于對照，但PEG+MAS與PEG處理組之間在CAT活性上沒有顯著差異(圖5D)。白三葉種子發(fā)芽過程中的FeSOD和CuZnSOD基因在PEG脅迫下相對表達(dá)量均升高，但PEG+MAS與PEG處理間差異不明顯。在MnSOD和POD的基因表達(dá)水平上，PEG+MAS比PEG處理分別高出了170%和307%，差異顯著。在PEG脅迫下，白三葉種子的CAT基因表達(dá)均顯著降低，且PEG+MAS與PEG處理間沒有顯著差異(圖6)。

圖4 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽活性氧、丙二醛和電解質(zhì)滲透率的影響Fig.4 Effect of the pretreatment of mannose on reactive oxygen species, MDA content and electrolyte leakage of white clover under drought stress

圖5 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽總抗氧化能力和抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of the pretreatment of mannose on total antioxidant capacity and antioxidative enzyme activities of white clover under drought stress

3 討論

圖6 甘露糖浸種對干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽抗氧化酶基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of the pretreatment of mannose on gene expression of antioxidant enzyme of white clover under drought stress

干旱是影響植物正常生長并使作物產(chǎn)量降低的主要非生物脅迫之一，前人的研究已證實(shí)植物體內(nèi)廣泛存在的單糖甘露糖(MAS)與植物抗逆性關(guān)系密切。Hameed等[23]研究發(fā)現(xiàn)干旱條件下，甘露糖預(yù)處理提高了小麥種子發(fā)芽的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化酶活性，提高種子萌發(fā)抗性。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較低濃度(0.5、1.0、2.0和5.0 mmol·L-1)的MAS浸種預(yù)處理均能顯著提高白三葉種子在18% PEG脅迫下的發(fā)芽率，但高濃度(10.0 mmol·L-1)的MAS卻對種子產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)一步降低了種子在PEG脅迫下的發(fā)芽，說明MAS提高白三葉種子發(fā)芽期抗旱性的效應(yīng)類似于其他植物生長調(diào)節(jié)劑，具有低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的特點(diǎn)。在種子萌發(fā)過程中，淀粉酶是催化淀粉水解的一類關(guān)鍵酶，幾乎存在于所有植物中，參與種子淀粉分解和轉(zhuǎn)化的淀粉酶主要有α-淀粉酶和β-淀粉酶[24]。種子萌發(fā)時(shí)，淀粉酶將淀粉分解成小分子糖類供幼苗生長[25]。李文嬈等[26]通過對水分脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)和高粱(Sorghumbicolor)種子萌發(fā)特性研究表明，水分脅迫通過限制種子吸水而抑制了種子內(nèi)萌發(fā)活性物質(zhì)的生成、轉(zhuǎn)化和運(yùn)輸(即淀粉水解生成可溶性糖,代謝過程受到抑制)等，繼而嚴(yán)重影響了種子的萌發(fā)活力，導(dǎo)致種子萌發(fā)速率和數(shù)量顯著下降。早期的研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺浸種預(yù)處理能顯著緩解PEG脅迫導(dǎo)致的白三葉種子萌發(fā)抑制，這與亞精胺提高PEG脅迫下種子萌發(fā)過程中的淀粉代謝有關(guān)[27]。在本試驗(yàn)中，PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫顯著抑制了白三葉種子萌發(fā)過程中淀粉的分解，但與未經(jīng)MAS預(yù)處理的種子相比較，MAS預(yù)處理提高了白三葉種子在PEG脅迫下的淀粉酶活性，從而有效緩解了PEG導(dǎo)致的淀粉代謝抑制。有趣的是在本試驗(yàn)中，PEG脅迫下經(jīng)MAS預(yù)處理和未經(jīng)MAS預(yù)處理的種子在發(fā)芽時(shí)可溶性糖含量沒有顯著差異，可能是由于種子發(fā)芽后期MAS誘導(dǎo)淀粉分解的可溶性糖用于維持種子在PEG脅迫下的生長，因?yàn)樵诟珊得{迫下MAS預(yù)處理后的種子生長更為良好(發(fā)芽后籽苗更大、根系更長)。

干旱脅迫下根系細(xì)胞受到傷害，代謝發(fā)生紊亂，將直接導(dǎo)致根系活力的下降[28]。郎冬梅等[29]研究發(fā)現(xiàn)，添加外源葡萄糖處理后山定子(Malusbaccata)幼苗根系活力顯著提高。本試驗(yàn)中2.0 mmol·L-1MAS浸種提高了干旱脅迫下種子發(fā)芽時(shí)的根系活力，一定程度上增強(qiáng)了根的吸水能力。此外，在根系吸水過程中滲透調(diào)節(jié)能力發(fā)揮重要作用，因此植物較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)能力常常與其較強(qiáng)的抗旱性呈正相關(guān)?？扇苄蕴呛陀坞x脯氨酸是植物體內(nèi)重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它們無毒且水合力強(qiáng)，可以保持細(xì)胞與環(huán)境滲透平衡，防止植物體內(nèi)水分散失，并對酶、蛋白質(zhì)及生物膜起保護(hù)作用[30-31]。劉艷等[32]研究發(fā)現(xiàn)甘草(Glycyrrhizauralensis)幼苗組織中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白、游離脯氨酸、可溶性糖含量在干旱脅迫下均顯著增加，提高了植株的吸水和保水能力，有效抵御干旱逆境。吳旭紅等[33]研究結(jié)果表明，0.6和0.9 mmol·L-1的外源亞精胺處理顯著提高了滲透脅迫下南瓜(Cucurbitamoschata)葉片的可溶性糖和脯氨酸含量，維持了較高的滲透緩沖和調(diào)節(jié)能力。李艷等[34]研究表明，殼寡糖處理油菜(Brassicanapus)幼苗，在干旱脅迫下其葉片游離脯氨酸含量顯著增高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，干旱脅迫下種子萌發(fā)時(shí)大量積累可溶性糖和游離脯氨酸，通過降低細(xì)胞滲透勢緩解干旱脅迫傷害。而對比干旱脅迫下MAS浸種預(yù)處理和未預(yù)處理兩個(gè)試驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，MAS浸種處理顯著提高了白三葉種子在PEG脅迫下游離脯氨酸的積累，PEG+MAS的滲透勢也顯著低于PEG處理組。說明2.0 mmol·L-1的MAS浸種使得白三葉種子發(fā)芽時(shí)積累了大量的游離脯氨酸并降低細(xì)胞滲透勢，從而提高白三葉種子的吸水保水能力，一定程度上維持了白三葉種子在干旱脅迫下的萌發(fā)能力。

當(dāng)植物遭受干旱脅迫時(shí)，植物體內(nèi)活性氧(ROS)大量積累，膜脂發(fā)生過氧化作用，膜的透性增加，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞功能受損，嚴(yán)重時(shí)致使植株死亡[4]?？寡趸烙到y(tǒng)是植物體內(nèi)維持ROS平衡的重要解毒系統(tǒng)，能降低植物細(xì)胞在干旱脅迫等非生物或生物脅迫下ROS的過量積累，以維持細(xì)胞良好的生理代謝功能。SOD是抵御活性氧的第一道防線，它能將超氧陰離子歧化生成H2O2和無毒的氧[35]。POD和CAT能進(jìn)一步將H2O2催化生成O2和水，從而減輕ROS在細(xì)胞內(nèi)的積累[36]。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶基因的表達(dá)是植物響應(yīng)干旱脅迫的重要分子機(jī)制[37]。Wang等[38]研究表明水稻(Oryzasativa)過量表達(dá)MnSOD基因能有效減輕PEG脅迫引起的氧化傷害，轉(zhuǎn)基因水稻抗旱性顯著高于野生型。本試驗(yàn)中正常水分條件下MAS預(yù)處理的白三葉在發(fā)芽過程中活性氧成分、MDA含量和EL水平均未發(fā)生變化，說明2.0 mmol·L-1MAS沒有對白三葉造成脅迫傷害。PEG脅迫下白三葉種子在發(fā)芽過程中活性氧顯著增多，而MAS浸種預(yù)處理的白三葉種子在PEG脅迫下的SOD和POD的活性增強(qiáng)，活性氧和MDA顯著降低?？寡趸傅幕虮磉_(dá)與酶活基本一致，MAS預(yù)處理的白三葉種子在PEG脅迫下MnSOD和POD基因表達(dá)量顯著升高，但MAS浸種對CAT活性及其基因表達(dá)沒有產(chǎn)生顯著影響。因此，低濃度的MAS浸種通過提高白三葉種子SOD和POD的活性及其基因表達(dá)從而提高了白三葉種子在PEG脅迫下的抗氧化能力，進(jìn)而有效緩解了活性氧對膜的傷害，提高了種子在發(fā)芽過程中的抗旱性。有趣的是干旱脅迫下CAT基因表達(dá)顯著下調(diào)，但CAT酶活顯著升高，推測酶活性的影響不僅僅受基因轉(zhuǎn)錄水平的直接調(diào)控，也受細(xì)胞水分狀態(tài)例如滲透調(diào)節(jié)和滲透保護(hù)的影響。

綜上所述，18% 的PEG干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽受到嚴(yán)重抑制，淀粉代謝減慢。而較低濃度的MAS浸種預(yù)處理能顯著提高干旱脅迫下白三葉種子的萌發(fā)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MAS浸種預(yù)處理使得種子在干旱脅迫下萌發(fā)時(shí)維持較好的淀粉代謝，積累更多的游離脯氨酸，滲透勢顯著降低，且顯著提高根系活力，從而增強(qiáng)了種子發(fā)芽時(shí)的吸水保水能力。此外，干旱脅迫下白三葉種子發(fā)芽時(shí)活性氧升高，膜脂過氧化加劇，種子發(fā)芽受到嚴(yán)重影響。而MAS浸種預(yù)處理能顯著提高干旱脅迫下種子發(fā)芽時(shí)總抗氧化能力、SOD和POD活性及其基因表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，從而有效緩解了活性氧積累對細(xì)胞膜的氧化損傷，提高抗逆性。