表面增強拉曼光譜在法庭科學領域的研究進展

雷 霏，王雅晨，孫其然，羅儀文，楊 旭

（1．華東政法大學，上海 200042；2．司法鑒定科學研究院 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海 200063）

拉曼光譜作為一種分子振動光譜，它能夠有效地利用光被分子散射后產(chǎn)生的頻率變化，從而進行定性與結(jié)構(gòu)分析，是目前快速無損檢測的一項有力工具，因而在諸多領域得到了廣泛的研究與應用，同時也在法庭科學領域中發(fā)揮著極大的作用。然而在實際檢驗過程中，受檢材自身條件的限制有時會難以得到效果良好的特征峰圖，于是有研究者開始致力于尋找更加有效的拉曼方法，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，表面增強拉曼光譜（SERS）因其增強效果和普適性較好開始得到眾多領域的研究與開發(fā)，同時也為法庭科學領域中各種物證的拉曼檢測提供了新的思路。

1 表面增強拉曼光譜的原理

拉曼光譜是一種用于確定系統(tǒng)結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)，但常規(guī)拉曼光譜（NRS）由于其散射的小截面通常會受到低靈敏度的限制或者對分析物的濃度要求較高[1]。SERS的發(fā)現(xiàn)在很大程度上彌補了這方面的不足，SERS技術(shù)是一種被廣泛應用于放大正常弱拉曼散射信號的技術(shù)，它的增強機理可以分為兩大類理論模型：物理類模型和化學類模型。物理類的主要代表是電磁場增強（electromagnetic enhancement，EM）模型，也就是表面等離子體共振模型，它認為當粗糙化的金屬基體表面受到光照時，金屬表面的等離子體能被激發(fā)到高的能級，與光波的電場耦合，并發(fā)生共振，使金屬表面的電場增強，產(chǎn)生增強的拉曼散射?；瘜W類的增強機理可以分為三類:一是金屬和吸附分子之間有電荷共振躍遷，即電荷轉(zhuǎn)移模型；二是吸附物和金屬基底的化學成鍵導致非共振增強；三是吸附分子和表面吸附原子形成表面絡合物（新分子體系）而導致的共振增強[2-4]。

2 研究進展

20世紀70年代初，有研究者發(fā)現(xiàn)粗糙的金屬表面可以增強拉曼散射的信號，于是表面增強拉曼光譜的概念應運而生，目前應用最廣泛的增強手段就是將拉曼光譜與納米技術(shù)相結(jié)合，利用表面粗糙的納米金屬材料，當分子吸附在這些材料表面時，拉曼信號可以得到增強。常用的金屬材料包括金、銀、銅等，而基于成本和增強效果的考慮，銀溶膠是目前各領域中研究和應用最多的一種增強基底[5-6]。目前國內(nèi)最廣泛使用的銀膠制備方法主要有LEE[7]和NICOLAE[8]的方法，LEE方法是將硝酸銀溶液煮沸后加入檸檬酸鈉溶液還原，在微沸騰狀態(tài)下持續(xù)攪拌反應，冷卻到室溫后離心水洗，定容后即可得到銀溶膠。而NICOLAE法與之原理相同，同樣是利用化學還原，將鹽酸羥胺與氫氧化鈉的混合溶液與硝酸銀溶液反應，持續(xù)攪拌后即可得到納米銀膠。

利用化學還原法來制備納米金屬粒子，一般都需要加熱攪拌的過程，然而一般的加熱攪拌過程，受攪拌區(qū)域、加熱面積等的限制很難達到均勻。有研究者開始嘗試使用微波加熱的方法，其輻射加熱的方式可以使溶劑中各處的溫度分布更為均勻，其穿透能力強，粒子在微波作用下也易于成核，這種方法可以使加熱過程更加快速均勻，是一種節(jié)能高效的制備途徑[9-11]。

金屬膠體顆?；蚱渌苣z在SERS中的效果與其的尺寸和形貌有關，在514.5 nm激光波長下，銀納米粒子的直徑在110~120nm范圍內(nèi)時的SERS能夠獲取最大的拉曼信號，對于647～488nm的激光波長，最佳粒徑范圍為70～200nm[12]。此外，LIBOR通過利用銀氨溶液的化學還原法制備銀膠體粒子，還原劑選用了木糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖四種不同結(jié)構(gòu)還原糖，在pH值維持在12.5的條件下進行反應，從中發(fā)現(xiàn)銀膠的尺寸和形態(tài)與銀氨溶液濃度以及還原糖種類有關，通過控制反應參數(shù)可以將納米銀粒子粒徑控制在增強效果最佳的范圍內(nèi)[13]。

通過各種途徑以納米銀膠為代表的增強基底制備方法，在眾多領域的表面增強拉曼中得到廣泛的應用，與此同時，在法庭科學領域，更多新型增強材料和檢測方法也開始在各方面的研究中嶄露頭角。目前，利用SERS檢測法庭物證的研究主要分為以下幾個方面。

2.1 SERS對書寫油墨的檢測研究

20世紀90年代開始，我國的研究者們開始利用拉曼光譜對書寫油墨進行檢測，最早由徐徹等[14]研究了傅里葉變換拉曼光譜鑒定黑色墨水，通過排除紙張干擾的情況下實現(xiàn)了種類的鑒別。但在對各種類型墨水進行檢測分析時，有些墨水的特征拉曼峰會受到熒光的干擾，有些則因超過CCD采集信號的范圍而無法采集[15]。為了解決這個問題，近年來，SERS對書寫油墨的檢測開始得到廣泛的研究和應用。IRINA等[16]選取了甲基紫羅蘭、蘇丹黑B、帕拉羅沙寧等10種代表性的有機染料，分別對其粉末與溶液進行了NRS、SERS的檢測，結(jié)果證明在NR光譜中受熒光影響而沒有得到明顯特征振動峰的染料分子，能夠在增強后出現(xiàn)較明顯的特征峰譜圖。此后，越來越多的研究者開始利用表面增強拉曼實現(xiàn)對書寫材料的檢測，并不斷開發(fā)新的增強方法。

ALYAMI等[11]用金納米棒代替一般使用的納米銀粒子，他們發(fā)現(xiàn)與普通的銀膠體相比，金納米棒的結(jié)構(gòu)具有更高的化學穩(wěn)定性，利用金納米棒垂直陣列對藍色圓珠筆進行檢測，獲得了強度高、重現(xiàn)性好的SERS光譜。RAZA等[18]將制備好的銀膠溶液與瓊脂糖粉混合，再進行水浴超聲加熱，加熱后的溶液冷卻凝固后制得凝膠塊，將制得的銀-瓊脂塊涂抹在紙張油墨表面進行拉曼檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用這種方法制備的增強基底不僅操作簡單、不易污染檢材，而且與普通的納米銀膠相比，它的增強效果更好。之后，ALI等[19]又在原方法的基礎上進行改進，將銀離子和瓊脂糖在水溶液中直接反應，在這種方法中，瓊脂可以作為自還原劑去還原銀離子，從而排除其他外部還原劑對納米顆粒的污染，他們把濾紙浸入制備好的熱溶液中，5s后取出并放置在常溫避光環(huán)境下，72 h之后，這種涂層紙條便可以發(fā)揮作用，將油墨書寫或滴涂在紙條上進行拉曼檢測，可以達到非常理想的增強效果。

2.2 SERS對毒物毒品的檢測研究

常規(guī)的毒物毒品檢測主要是利用分光光度法、色譜法、質(zhì)譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)，這些方法都需要樣品預處理，過程復雜且耗時較長，而在案件的偵查過程中，涉及到一些種屬認定、未知物篩查等過程，往往需要更加快捷的方式。近年來，拉曼光譜已被廣泛應用到毒品檢測的領域。目前市面上的毒品種類繁多，各種新型毒品層出不窮，其組成和結(jié)構(gòu)都較為復雜，再加上實際案件中待測樣品含量往往較低，因此，常規(guī)檢測獲取的拉曼光譜有時會出現(xiàn)信噪比低、特征峰被淹沒的情況，表面增強拉曼光譜技術(shù)很好地解決了這一問題。

王磊等[20]用金納米棒作為增強基底來檢測人體尿液中甲基苯丙胺（MAMP）和亞甲基苯丙胺（MDMA）的表面增強拉曼光譜，再將測得的譜圖通過自適應平滑濾波器進行光譜去噪，由小波變換（根據(jù)信號頻率的不同，將信號按多尺度分解，依據(jù)尺度信息調(diào)整取樣步長，聚焦于信號中的特定頻率分量）實現(xiàn)光譜中最優(yōu)數(shù)據(jù)的降維，通過交叉驗證（cross validation，CV）實現(xiàn)支持向量機分類器參數(shù)尋優(yōu)，并根據(jù)交叉驗證與分類器之間的準確率關系，得到分類器可用參數(shù)需要滿足的條件。通過這種與物理相結(jié)合的方法可以將測試結(jié)果的準確率提高到95%以上。YANG等[21]開發(fā)了一種離子束濺射技術(shù)來制備一維半導體納米結(jié)構(gòu)，在硅襯底上合成二維銀納米線型陣列作為增強基底，對比發(fā)現(xiàn)這種增強基底比普通的薄膜基底高出10～100倍的SERS敏感度，他們用這種方法來檢測鹽酸氯胺酮的SERS，檢測結(jié)果可以達到27ppb。DAO等[22]對常用除草劑百草枯（para quat，PQ）進行表面增強拉曼的檢測，這是一種近年來備受關注的對人傷害極大的毒物，他們將硝酸銀溶液和氫氟酸在硅片的表面分別進行化學沉積和電沉積，制備成銀納米樹突狀體（AgND3）。比較發(fā)現(xiàn)電沉積形成的AgND3具有更好的分枝，能夠使枝晶密度更厚，排列更有序，這大大提高了底物的增強因子。因此，由電沉積制備的AgND3活性底物能夠檢測到低至0.01 ppm的PQ，而相比之下化學沉積制備的AgND3只能檢測到高幾百倍濃度的PQ。INSCORE等[23]用玻璃毛細管固定金、銀溶膠，制備出了SERS毛細管柱，用固相萃取法將摻雜可卡因、苯丙胺、海洛因等藥物的唾液樣本注入柱中，使藥物與唾液實現(xiàn)分離，用便攜式拉曼光譜儀檢測唾液中的藥物成分，在10min內(nèi)成功檢測出唾液中5種不同的藥物，這種方法為將來刑事偵查中手持SERS分析儀的現(xiàn)場檢測提供可能。

2.3 SERS對爆炸殘留物的檢測研究

近年來，由刑事犯罪、恐怖襲擊等所引發(fā)的爆炸事件越來越多，爆炸品殘留物的分析檢測也開始成為法庭科學中的熱點之一，爆炸物的主要成分是一種或多種炸藥，多含有C、H、O、N等元素，一般為含有某種爆炸性基團的化合物或混合物。SERS可以對爆炸物分子實現(xiàn)指紋譜性、超痕量、實時高效的探測和識別，因此，國內(nèi)外針對表面增強拉曼檢測爆炸物的研究十分活躍。值得一提的是，NRS與SERS的峰位并不完全一致，爆炸物和基底之間的吸附作用可使表面增強拉曼光譜峰位發(fā)生位移，而表面活性劑或穩(wěn)定劑的拉曼峰有時會與爆炸物拉曼峰位置重疊，這大大加大了光譜識別的難度。因此，很多研究者致力于開發(fā)各種新型增強基底應用于爆炸物的SERS檢測[24]。

LIU等[25]以EHDAB（乙基十六烷基二甲基溴化銨， ethylhexadecyldimethyl ammonium bromide）作為穩(wěn)定劑，利用種子生長法（seed-mediated growth）制備了八面體型納米金，并采用一種簡單的液滴蒸發(fā)法制備了基于金納米粒子的SERS基底，下圖展示了納米結(jié)構(gòu)陣列的制造過程，在毛細管和界面力的相互作用下，金八面體納米粒子自發(fā)地緩慢沉降，并排列成雙層有序結(jié)構(gòu)，隨著溶劑的蒸發(fā)，形成了二維及三維的金納米結(jié)構(gòu)組裝體（圖1）。

圖1 圖式顯示了一個由乙基十六烷基二甲基溴化銨（EHDAB）雙層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的金八面體，以及可以誘導產(chǎn)生有序金納米粒子超結(jié)構(gòu)的液滴蒸發(fā)技術(shù)[25] 。

這種增強基底可以檢測到濃度低至10-9mol/L的TNT（2，4，6-Trinitrotoluene）清晰譜圖，他們又將 TNT譜圖與 DNT（dinitrotoluence）、2-NT（2-nitrotoluene）、NB（nitrobenzene）等作對比分析，發(fā)現(xiàn)TNT的拉曼特征峰與其他幾種檢測化合物有明顯的差異[25]。

KANCHANAPALLY等[26]用氧化石墨烯-金籠狀納米結(jié)構(gòu)作為增強基底檢測TNT和RDX（hexogen），一方面利用帶負電荷的氧化石墨烯吸引硝基爆炸物分子，提高化學增強；另一方面納米籠狀結(jié)構(gòu)可以增強局域電場耦合，從而提高拉曼信號的強度，結(jié)果表明該方法測得的爆炸物譜圖能夠提高大約4個數(shù)量級的拉曼散射信號，在對RDX的檢測中，增強因子可以達到1.6×1011。

GONG等[27]通過自下而上的策略，將銀納米粒子通過自組裝或原位生長的方式構(gòu)筑到棉簽頭部，制備出可以直接用于檢測的SERS棉簽拭子，用其來檢測玻璃表面按壓留下的2，4-DNT（2，4-二硝基甲苯），得到了清晰的拉曼譜圖。

WANG等[28]根據(jù)狗的嗅覺特點設計出一種結(jié)合SERS檢測晶體化合物氣相的電子鼻傳感器，用p-氨基苯乙硫醇（PABT）對逐層打印的噴墨印刷納米銀紙進行了改進，通過電荷轉(zhuǎn)移反應有效地收集了氣相TNT，并通過多種光譜共振，大大增強了PABT的拉曼散射，檢測能夠達到1.6×10-17g/cm2靈敏度。利用這種方法，可以快速檢測土壤、信封、衣物等物體上的TNT殘留物，未來有望在刑事現(xiàn)場勘查、安檢等方面實現(xiàn)爆炸物的快速有效識別。

2.4 SERS對其他相關檢材的檢測研究

除了上述的幾種檢測對象外，SERS在法庭科學領域還有很多其他方面的研究。其中，染料是最常見的一類檢測對象，除了上述所提到的書寫材料中含有染料外，其他物證也會涉及到染料的檢測，比如毛發(fā)，毛發(fā)是犯罪現(xiàn)場最常見的物證之一，毛發(fā)證據(jù)的分析對于刑事偵查來說具有重要的價值，而染發(fā)劑則是頭發(fā)中最常出現(xiàn)的一種成分。KUROUSKI等[29]對人體頭發(fā)上的染色劑進行SERS檢測，他們將頭發(fā)樣本進行常規(guī)的染發(fā)處理，選用金納米粒子作為增強基底，通過便攜式拉曼光譜儀成功檢測出頭發(fā)上的染色劑成分。鞋油往往是犯罪現(xiàn)場不易察覺卻又至關重要的證據(jù)，但是由于鞋油成分中含有蠟，而蠟的高度重疊吸收干擾了拉曼的檢測，因此成為一大難點。MUEHLETHALER等[30]研究了鞋油的SERS檢測，將1 mL染料丙酮溶液、1 mL銀膠水溶液和1mL 0.5mol/L的硝酸鉀溶液混合在一起，對形成的聚合劑進行檢測，并將結(jié)果與干粉染料的常規(guī)拉曼譜圖作對比，發(fā)現(xiàn)SERS能夠清晰的表征鞋油的染料分子，部分在NRS下沒有響應信號的染料成分也能在SERS中檢測到。

生物檢材也是法庭科學中重要分析對象。CHEN等[31]研究了人體精液的SERS檢測，選取體積、濃度、運動活力相差較大的兩組精漿分別標記為正常組和異常組，將精漿與銀溶膠按1∶1混合后轉(zhuǎn)移到矩形鋁板上，之后在拉曼探針中加入了不同的偏振器，以不同的偏振光激發(fā)樣品，從而測得增強效果下的拉曼光譜和偏振拉曼光譜。精漿的SERS光譜反映了檸檬酸、鳥嘌呤和纖維素等生物分子信息，而利用偏振光可以更有效的識別正常組與異常組精漿生物分子的微小差異。此外，WANG等[32]還將拉曼增強運用于人體血液球蛋白的檢測，他們開發(fā)了一種結(jié)合膜電泳和SERS技術(shù)進行血漿分析的新方法，將切斷后的球蛋白帶與被醋酸溶解的銀納米粒子混合，然后離心收集上清液，再將得到的球蛋白-銀納米粒子混合物進行SERS檢測，最后得到了有效的血型鑒定數(shù)據(jù)，為血型分析提供了新的思路。

3 總結(jié)

綜上所述，SERS在法庭科學領域扮演著相當重要的角色，隨著近年來科技的不斷進步，國內(nèi)外眾多的研究者們針對不同的檢測對象開發(fā)出各種新型增強技術(shù)，盡管目前的SERS技術(shù)依舊面對著諸如：增強基底不易長期穩(wěn)定存儲；檢測過程容易污染檢材等問題，探索更多成本低、效率高、循環(huán)性好的增強方法是當下研究領域的焦點，隨著研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，SERS必將在法庭證據(jù)的檢測中發(fā)揮越來越大的作用。