糖皮質(zhì)激素廣譜特異性單克隆抗體的制備及其ic-ELISA方法的建立

姚添淇，勞翠瑜，王士峰，胡桂平，張世偉*

（廣東省深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東 深圳 518060）

糖皮質(zhì)類激素是類固醇激素類的一種，具有強大的抗炎、抗過敏、免疫抑制和抗增生的作用[1]。在養(yǎng)殖業(yè)方面，糖皮質(zhì)激素能促進動物的非正常生長，可以大幅提高動物養(yǎng)殖的經(jīng)濟效應(yīng)，所以在養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用[2]。但是濫用糖皮質(zhì)類激素會使其在動物組織中及奶制品中存在不同程度的殘留，人體長期食用這些殘留有糖皮質(zhì)激素的食品會導(dǎo)致機體代謝紊亂和發(fā)育異常等狀況[3-4]。另外有一些不法商販通過對一些保健品、中藥材等非法添加糖皮質(zhì)激素[5-7]，會使消費者在食用后短期內(nèi)出現(xiàn)一些積極作用，但長期攝入則可能會引起內(nèi)分泌失調(diào)、致畸、致癌、水腫、糖尿病等嚴(yán)重后果[8-9]。

隨著近年來人民生活水平在不斷提高，人們的飲食觀念也從注重食品數(shù)量向注重食品質(zhì)量轉(zhuǎn)變，食品安全既關(guān)系到人民群眾的切身健康也關(guān)系到我國食品行業(yè)的良性發(fā)展。在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，不法商販非法濫用糖皮質(zhì)激素的情況不容樂觀[10-11]。在我國農(nóng)業(yè)部2002年235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[12]對各類糖皮質(zhì)類激素進行了最高限量值的規(guī)定，歐盟、日本等國際組織或國家也禁止對食品源性動物使用糖皮質(zhì)類激素?，F(xiàn)有常用的糖皮質(zhì)激素檢測方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[13-15]，這些方法均需要采樣后返回實驗室內(nèi)運用大型設(shè)備儀器進行檢測，對于檢測的便利性與時效性無法保證，建立一種快速、簡單、可靠的檢測方法具有重要意義。

圖1 幾種常見的糖皮質(zhì)激素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of several common glucocorticoids

糖皮質(zhì)激素的種類多樣，常見的糖皮質(zhì)類激素包括氫化可的松、可的松、地塞米松、曲安奈德、丙酸氯倍他索、倍他米松、潑尼松和潑尼松龍等。如圖1所示，幾種常見糖皮質(zhì)激素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖具有類似的母環(huán)結(jié)構(gòu)，也具有不同程度但作用相似的抗炎和促進非正常生長等作用。為應(yīng)對不法商家違規(guī)使用或添加不同種類糖皮質(zhì)激素的現(xiàn)象，除達到檢測方法的靈敏度外，也要求檢測方法具有一定廣譜特異性。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)基于異源策略的酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）可以顯著提高檢測小分子的靈敏度[16-23]。本實驗通過篩選得到氫化可的松單克隆抗體，對12 種糖皮質(zhì)激素進行同源和異源包被的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA），為更好地應(yīng)對不同種類糖皮質(zhì)類激素殘留的檢測需求提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液體乳樣品 中國伊利集團；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為本實驗室保存；6～8 周齡雄性SPF級Balb/c小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心。

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、鑰孔戚血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 美國Sigma公司；免疫佐劑 北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸氟氫可的松、倍氯米松、倍他米松、乙酸地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；丙酸氯倍他索 中國Adamas-beta公司；可的松、曲安奈德、氫化可的松、地塞米松百靈威科技有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒湖南艾佳生物科技公司；高糖DMEM細胞培養(yǎng)基（DMEM-GlutaMAX）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素-鏈霉谷-氨酰胺混合液（100×）、HAT添加劑（50×）、HT添加劑（100×） 美國Gibco公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體 美國Arista Biologicals公司；ELISA酶標(biāo)板 美國Corning公司。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：pH 7.4，0.2 g/L KH2PO4，2.9 g/L Na2HPO4·H2O，0.2 g/L KCl，8.5 g/L NaCl；PBST：含0.05% Tween 20的PBS；包被液：pH 9.6，0.75 g Na2CO3，1.46 g NaHCO3；封閉液：5%脫脂奶粉溶解于PBS。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyH1酶標(biāo)儀、96 孔酶聯(lián)免疫洗板機 美國BioTek公司；超純水機 美國Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 氫化可的松半抗原HYD及地塞米松半抗原DEX合成

氫化可的松半抗原HYD合成（圖2）：稱取氫化可的松0.18 g、丁二酸酐0.15 g于50 mL圓底燒瓶中，加入無水吡啶5 mL，混合后在60 ℃反應(yīng)8 h，停止加熱后冷卻至室溫，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至20 mL 10%的HCl冰水浴中，有大量白色沉淀析出，過濾后用去離子水洗滌數(shù)次，干燥后得半抗原白色固體約138 mg。

地塞米松半抗原DEX合成（圖2）：稱取地塞米松0.16 g、丁二酸酐0.12 g于50 mL圓底燒瓶中，加入無水吡啶5 mL，混合后在60 ℃反應(yīng)8 h，停止加熱后冷卻至室溫，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至20 mL 10%的HCl冰水浴中，有大量白色沉淀析出，過濾后用去離子水洗滌數(shù)次，干燥后得半抗原白色固體約130 mg。

圖2 氫化可的松半抗原HYD及地塞米松半抗原DEX合成Fig. 2 Synthesis of haptens from HYD and from DEX

1.3.2 完整抗原合成與鑒定

完整抗原參考活潑酯法[24]進行合成，將氫化可的松半抗原HYD分別與載體蛋白KLH和OVA偶聯(lián)得到完整抗原KLH-HYD和OVA-HYD，地塞米松半抗原DEX與載體蛋白OVA偶聯(lián)得到OVA-DEX，其中合成的KLH-HYD作為小鼠的免疫抗原，OVA-HYD和OVA-DEX作為酶聯(lián)反應(yīng)的包被抗原，合成的完整抗原均采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定其質(zhì)量濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 動物免疫與細胞融合

選取8 只6～8 周齡雄性Balb/c小鼠，將KLH-HYD完整抗原稀釋至2 μg/μL，稀釋后的完整抗原與商品化佐劑按照1∶1比例振蕩混合均勻，吸取100 μL混合抗原對每只小鼠腿部進行肌肉注射，第一次免疫后于第6、13天以同樣條件對小鼠進行加強免疫，在第20天時對小鼠進行尾靜脈取血，采用ic-ELISA方法檢測小鼠血清的親和力及特異性，選取血清效價1∶20 000以上中抑制率最高的小鼠進行腹腔注射KLH-HYD完整抗原沖擊免疫，3 d后無菌提取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合[25]。

1.3.4 單克隆抗體的篩選與腹水制備

細胞融合10 d后在顯微鏡下觀察細胞融合率達100%，在融合第12天后，觀察大部分孔內(nèi)雜交瘤細胞長至約1/4孔底面積時對細胞上清液進行ic-ELISA檢測，后經(jīng)過多輪篩選驗證及亞克隆，獲得1 株穩(wěn)定分泌抗氫化可抗體的細胞株（命名為HYD-C1）。利用HYD-C1細胞株誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生腹水，將獲得的腹水抗體通過辛酸硫酸銨沉淀法進行純化[26]，純化后產(chǎn)物分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 ic-ELISA的建立

使用棋盤法[27]分別確定同源策略（包被原為OVAHYD）和異源策略（包被原為OVA-DEX）下抗原及包被原的最佳工作質(zhì)量濃度。利用棋盤法中得到的最佳工作質(zhì)量濃度，以4 倍稀釋法制備不同質(zhì)量濃度的氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)液作為競爭物，分別建立同源和異源策略氫化可的松ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)合率按照公式（1）計算：

式中：B為一定競爭物氫化可的松質(zhì)量濃度時在450 nm波長處的OD值；B0為不加任何抑制物時在450 nm波長處的OD值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線以氫化可的松質(zhì)量濃度的常用對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，當(dāng)結(jié)合率為50%時相應(yīng)的抑制物質(zhì)量濃度即為IC50值，以此評價其靈敏度，對比兩種不同策略下的檢測結(jié)果。

1.3.6 糖皮質(zhì)激素交叉抑制檢測

利用棋盤法優(yōu)化后得到的ic-ELISA工作條件，分別在包被同源抗原OVA-HYD及包被異源抗原OVA-DEX的情況下，采用4 倍稀釋法檢測得到的氫化可的松單克隆抗體對地塞米松、乙酸地塞米松、可的松、乙酸氟氫可的松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、倍氯米松、倍他米松、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松11 種糖皮質(zhì)激素進行交叉抑制檢測，分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每種糖皮質(zhì)激素對應(yīng)半抑制濃度IC50值、檢測限IC10值，交叉反應(yīng)率根據(jù)公式（2）計算：

式中：IC50氫化可的松為抑制物為氫化可的松時的半抑制濃度/（ng/mL）；IC50目的抑制物為待測目的抑制物的半抑制濃度/（ng/mL）。

計算出每種糖皮質(zhì)激素對應(yīng)氫化可的松在同源及異源策略情況下的交叉反應(yīng)率，對比兩種策略下的氫化可的松單克隆抗體的廣譜特異性情況。

1.3.7 添加回收實驗

將篩選出具有交叉反應(yīng)的糖皮質(zhì)激素分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，添加至正規(guī)超市中采購的液體乳樣品中，首先使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定出空白液體乳樣品中的待測的各糖皮質(zhì)激素含量，在此基礎(chǔ)上分別在液體乳中添加已知含量的各類糖皮質(zhì)激素，振蕩混勻，采用ic-ELISA，扣除空白樣品中本底值后計算各種糖皮質(zhì)激素的添加回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖像處理

利用Origin pro 2018及Excel等軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及分析數(shù)據(jù)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式由ChemBioDraw Ultra 14.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原抗體最佳工作質(zhì)量濃度確定

基于棋盤法對OVA-HYD和OVA-DEX兩種包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度及純化后的抗體稀釋倍數(shù)進行確定。確定工作質(zhì)量濃度如下：同源包被抗原OVA-HYD和異源包被抗原OVA-DEX的最佳工作質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，腹水抗體HYD-C1的最佳稀釋倍數(shù)為10 000 倍。

2.2 同源及異源策略ic-ELISA

圖3 同源（a）和異源（b）策略ic-ELISA法檢測氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curves for detection of hydrocortisone using homologous (a) and heterologous (b) ic-ELISA

根據(jù)優(yōu)化后的最佳抗原抗體工作質(zhì)量濃度，以4 倍稀釋法分別建立氫化可的松同源及異源策略ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，同源策略IC50氫化可的松為1.63 ng/mL；異源策略IC50氫化可的松為0.24 ng/mL。結(jié)果表明在異源策略中氫化可的松的靈敏度大幅高于同源策略中得到的結(jié)果。

2.3 糖皮質(zhì)激素交叉抑制檢測結(jié)果

表1 基于單克隆抗體建立的同源及異源策略ic-ELISA法對糖皮質(zhì)激素的靈敏度及交叉反應(yīng)率檢測結(jié)果Table 1 Cross-reactivity of monoclonal antibody against hydrocortisone with other glucocorticoids in homologous and heterologous ic-ELISA

如表1所示，在用OVA-HYD同源包被情況下，可的松、乙酸氟氫可的松、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松、倍氯米松6 種糖皮質(zhì)激素有較明顯交叉抑制，交叉反應(yīng)率分別為38.6%、8.89%、70.78%、205.52%、2.52%和0.36%，剩余5 種糖皮質(zhì)激素的靈敏度IC50值均大于1×103ng/mL，無明顯交叉抑制情況；在OVA-DEX異源包被情況下，5 種在同源情況下無交叉抑制的糖皮質(zhì)激素也出現(xiàn)了明顯抑制情況，靈敏度范圍從0.19 ng/mL（乙酸氟氫可的松）到79.29 ng/mL（倍他米松），交叉抑制率范圍從0.3%（倍他米松）到126.32%（乙酸氟氫可的松）。結(jié)果表明，在同源和異源策略下該單克隆抗體都具有糖皮質(zhì)激素廣譜特異性，但在異源策略下對各種糖皮質(zhì)激素的靈敏度較之同源包被的情況發(fā)生了較大程度的提高，也具有更廣譜的糖皮質(zhì)激素抑制特征。

2.4 添加回收實驗結(jié)果

表2 基于單克隆抗體建立異源策略ic-ELISA法對糖皮質(zhì)激素的添加回收檢測結(jié)果Table 2 Recoveries of spiked glucocorticoids by heterologous ic-ELISA

續(xù)表2

如表2所示，在異源策略中平均添加回收率在77.5%～111.3%之間，變異系數(shù)在1.2%～8.6%之間，結(jié)果表明異源策略ic-ELISA檢測的糖皮質(zhì)激素添加回收率落在合理范圍內(nèi)，符合檢測所需指標(biāo)，方法重復(fù)性較好、可以滿足于液體乳樣品中激素殘留的檢測需求。

3 結(jié) 論

本研究將氫化可的松半抗原HYD與KLH利用活潑酯法連接成完整抗原KLH-HYD使小鼠免疫，將HYD及地塞米松半抗原DEX分別與OVA連接成OVA-HYD和OVA-DEX完整抗原用作包被抗原，后取小鼠脾臟與SP2/0細胞進行細胞融合篩選得到1 株穩(wěn)定分泌氫化可的松抗體的單克隆抗體，命名為HYD-C1，并利用該細胞株大量制備氫化可的松腹水抗體。以O(shè)VA-HYD作為同源包被源，以O(shè)VA-DEX作為異源包被源，利用得到的抗體分別建立同源策略及異源策略的氫化可的松ic-ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)在異源策略下的靈敏度（0.24 ng/mL）比同源策略下的（1.63 ng/mL）高出近1 個數(shù)量級。

利用該抗體在不同策略下進行11 種糖皮質(zhì)激素的廣譜特異性檢測，發(fā)現(xiàn)在異源策略下11 種糖皮質(zhì)激素的檢測靈敏度均明顯提高，在同源策略下沒有明顯抑制的地塞米松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、乙酸地塞米松和倍他米松5 種糖皮質(zhì)激素均在異源策略下發(fā)生明顯抑制，說明在異源策略中該抗體對應(yīng)的糖皮質(zhì)激素抑制譜更寬，靈敏度也更高。在異源策略下液體乳的糖皮質(zhì)激素添加回收實驗中平均添加回收率在77.5%～111.3%之間，在合理范圍區(qū)間，重復(fù)性較好，本方法中對于氫化可的松、可的松、乙酸氟氫可的松、潑尼松和潑尼松龍的檢測限均能達到GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中檢測低限，該方法的廣譜特異性可良好運用于對液體乳樣品中糖皮質(zhì)激素殘留的現(xiàn)場初篩檢測。

本研究著重對比了氫化可的松抗體在同源策略與異源策略下對各種不同種類的糖皮質(zhì)激素的結(jié)合情況，推測存在異源包被的抗原在與抗體結(jié)合時的作用力要弱于同源包被時的情況，繼而使得游離抑制物可以更容易與包被抗原競爭性地與抗體結(jié)合，使得許多在同源情況下不具備競爭能力的糖皮質(zhì)激素在包被抗原結(jié)合力變?nèi)鯐r相對也具備了競爭優(yōu)勢，但具體的分子作用力之間的機理有待進一步研究。異源策略大幅加強了抗體對具有類似結(jié)構(gòu)的其他糖皮質(zhì)激素的檢測靈敏度，拓寬了糖皮質(zhì)激素的檢測譜寬，這一策略可以更好地應(yīng)用于需要進行廣譜篩查的日常檢測工作中，也為其他有提高靈敏度或提高廣譜特異性需求的研究提供參考。