茯磚茶中冠突散囊菌的分離鑒定及其在液態(tài)發(fā)酵中的應用

王 昕，張宇翔，任婷婷，趙倩囡，岳田利*，袁亞宏*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

茯磚茶屬于一種發(fā)酵黑茶，至今已有幾百年的歷史，產(chǎn)銷量一直占據(jù)黑茶市場的首位。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯磚茶在特定溫度、濕度條件下，通過“發(fā)花”工藝長成的自然益生菌體，俗稱“金花”，是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌之一[1-3]。胡治遠等[4]研究報道，“金花”菌是茯磚茶加工過程中發(fā)花階段的主導微生物，對茯磚茶醇香、濃厚的風味及健康功效有重要貢獻；胡謝馨等[5]研究表明“金花”菌對野葛、粉葛、葛渣固體發(fā)酵后總黃酮和葛根素含量的增加有很大貢獻。冠突散囊菌發(fā)酵[6]可使茶的成分發(fā)生很大變化[7-11]，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物和水解產(chǎn)物以及有機酸等活性物質(zhì)，使發(fā)酵茶具有降脂[12-15]減肥、改善人體消化道功能[16]、治療心血管疾病[17-18]等保健功效[19-21]。有研究報道，一種從海藻中提取分離的內(nèi)生真菌冠突散囊菌可產(chǎn)生蒽醌類化合物，從而使其具有止血、抗菌、瀉下、利尿的作用[22]；Salazar等[23]研究表明冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物Compound 1具有抑制細胞生長的作用，在抗癌、抗腫瘤的應用上有很重要的參考價值；李佳蓮等[24]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等有較強的抑制作用。

以往對冠突散囊菌的研究主要集中在茶葉固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵周期長、工藝難控制且原料要求高（多以黑毛茶為原料，一級鮮葉要求一芽二三葉，二級一芽三四葉，三級一芽四五葉，四級一芽五六葉或開面葉），而對冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵研究較少且鮮見關于茶水浸提液滅菌處理影響主要理化指標的研究，為進一步縮短發(fā)酵周期[25]，同時解決由于夏秋茶滋味苦澀品質(zhì)差不能被有效開發(fā)利用的問題[26]，本實驗著重研究冠突散囊菌的分離鑒定、生長特性，以夏秋茶（平利山茶）浸提液為原料，分離得到的冠突散囊菌作為發(fā)酵菌種，進行液態(tài)發(fā)酵制備富含冠突散囊菌菌絲體的發(fā)酵黑茶產(chǎn)品。為進一步揭示冠突散囊菌在液態(tài)發(fā)酵中的調(diào)控機制提供理論支持，為冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

手筑茯磚茶1 000 g，購自湖南益陽捷飲茶業(yè)有限公司；平利山茶（夏秋茶），2017年10月采自陜西省安康市平利縣茶園。

沒食子酸（分析純，純度98.5%）、谷氨酸（純度＞99%） 上海源葉生物科技有限公司；一水合茚三酮（純度＞97%） 北京奧科生物科技有限公司；福林-酚試劑（生化試劑，濃度1 mol/L） 上海荔達生物科技有限公司；Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒 北京奧科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱、ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司；SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；CFX CONNCT聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；JY600C電泳儀 北京市六一儀器廠；DGX-9143BC電熱恒溫鼓風干燥箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；YT-CJ-2ND超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Ni-U光學顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制作與茶樣制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。稱取去皮馬鈴薯200 g，切片加1 000 mL蒸餾水，煮沸10～20 min，用紗布過濾，補加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值自然[27]。

茶葉制備：將鮮葉經(jīng)滾筒烘干制成干茶密封保存?zhèn)溆?，?GB/T 8302—2013《茶 取樣》[28]的規(guī)定取樣，并按GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測定》[29]的規(guī)定，制備試樣。

1.3.2 冠突散囊菌的分離純化

取樣器具用75%乙醇溶液消毒，將實驗手筑茯磚茶于超凈工作臺操作。五點取樣法將每部分所取樣品混勻，然后稱取10 g茶樣于盛有250 mL 0.85%無菌生理鹽水的500 mL三角瓶中。28 ℃搖床洗脫2 h，洗脫茶樣中的霉菌孢子。將洗脫得到的茶樣原液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取各梯度洗脫液100～200 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，每個梯度3 個平行。28 ℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天至長出菌落，挑取形態(tài)不同的單菌落于PDA培養(yǎng)基上劃線純化多次，直至得到單菌落，進行形態(tài)觀察和斜面保存。

1.3.3 分子生物學鑒定

對PDA培養(yǎng)得到的單菌落，采用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit提取基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對所選菌株進行PCR擴增。PCR擴增體系：20 μL的總反應體系中包含上下游引物各1 μL（5.94 nmol，稀釋100 倍），2 μL模板DNA，10 μL premix Taq，加無菌水至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統(tǒng)拍照，將單一透亮條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序得到的序列和GenBank中序列進行比對，確定相似度高的序列，得到目標菌株冠突散囊菌。采用Cluxtal-X對基因序列進行比對，并用MEGA6.0對相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其系統(tǒng)發(fā)育學地位。

1.3.4 生長特性分析

將斜面保存的冠突散囊菌于PDA培養(yǎng)基上活化1～2 次，用接種環(huán)挑取適量黃色閉囊殼于無菌生理鹽水，振搖均勻，血球計數(shù)使得孢子懸浮液濃度為107CFU/mL。以2%接種量接種孢子懸浮液于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)8 d。每隔12 h取出三角瓶，將培養(yǎng)液過濾于濾紙上，100～105 ℃烘至質(zhì)量恒定。以時間為橫坐標，菌體干質(zhì)量為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.5 形態(tài)學特征觀察

取斜面保存的冠突散囊菌劃線接種于PDA培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并進行菌落特征、顯微形態(tài)及掃描電鏡的形態(tài)學研究。

1.3.6 山茶浸提液制備

參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》[30]和文獻[31]，平利山茶與蒸餾水比例為1∶25（g/mL），沸水浴浸提45 min，待浸提液冷卻后離心取上清液，得到山茶浸提液。

1.3.7 孢子懸浮液制備

將斜面保存的HNYYWX.13冠突散囊菌于PDA培養(yǎng)基上活化1～2 次，用接種環(huán)挑取適量黃色閉囊殼于無菌生理鹽水，振搖均勻，血球計數(shù)使得孢子懸浮液濃度為107CFU/mL，即得液態(tài)發(fā)酵所用孢子懸浮液。

1.3.8 冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵

以2%接種量將冠突散囊菌的孢子懸浮液分別接種到100 ℃、15 min滅菌的山茶浸提液、不滅菌的山茶浸提液（均不添加蔗糖）和添加4%蔗糖的山茶浸提液、不添加4%蔗糖的山茶浸提液（均不滅菌）中，28 ℃、120 r/min搖床發(fā)酵。分別于0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180 h測定發(fā)酵液的茶多酚總量、氨基酸總量，探究滅菌處理及碳源對冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵的影響。

1.3.9 指標測定

參考GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[32]和GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[33]的方法分別測定發(fā)酵液中的茶多酚總量和氨基酸總量，得到標準曲線，茶多酚總量標準曲線為：Y=0.008 7+0.012 31X，R2=0.999 06；氨基酸總量標準曲線為：Y=0.875 78X-7.241 38×10-4，R2=0.998 17。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過OriginPro 9.0作圖，SPSS 20.0作統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子生物學鑒定

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳

圖1 茯磚茶部分優(yōu)勢菌種的PCR擴增產(chǎn)物電泳分析圖Fig. 1 PCR amplification of fungal ITS from Fuzhuan tea

茯磚茶中所分離出的部分菌種的ITS序列擴增產(chǎn)物電泳分析見圖1。3～13號泳道的條帶分子質(zhì)量約處于500～750 bp，且均呈現(xiàn)單一、明亮，表明此11 株菌的DNA純度較高、無污染，可送去基因測序進一步鑒定。

2.1.2 基因測序

表1 湖南益陽茯磚茶測序結(jié)果Table 1 Results of sequencing of 33 strains in Fuzhuan tea from Yiyang, Hunan province

從表1可以看出，在湖南益陽茯磚茶中所分離的33 株菌中，編號分別為HNYYWX.1、HNYYWX.3、HNYYWX.5、HNYYWX.10、HNYYWX.17、HNYYWX.21、HNYYWX.22、HNYYWX.28的8 株菌經(jīng)過在GenBank中BLAST比對后，與數(shù)據(jù)庫中冠突散囊菌的模式菌株（JQ743649.1）相似度均達到99%，編號為HNYYWX.13的菌株相似度為100%，因此選擇HNYYWX.13菌株進行冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵研究。

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從GenBank下載冠突散囊菌模式菌株或公認菌株的相應基因序列，以JQ743649.1（模式菌株）為參比，用MEGA 6.0軟件采用Neighbor-Joining Tree法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，編號為HNYYWX.1、HNYYWX.3等21 株菌與模式菌株JQ743649.1優(yōu)先聚集到一起，系統(tǒng)發(fā)育學分析表明其與模式菌株的親緣關系非常接近；在此親緣關系下，菌株HNYYWX.7和HNYYWX.27、HNYYWX.10和HNYYWX.18差異更小。系統(tǒng)發(fā)育學地位分析為研究相似菌株的差異性提供了很好的參考和指導。

圖2 茯磚茶分離株ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 NJ phylogenetic tree based on ITS sequences of fungi in Fuzhuan tea

2.2 冠突散囊菌生長曲線

如圖3所示，培養(yǎng)0～12 h時，由于PDB培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，冠突散囊菌很快適應生長環(huán)境，大量吸收培養(yǎng)基中的碳源等營養(yǎng)物質(zhì)，促使無性孢子迅速萌發(fā)生長，使得前12 h菌絲體干質(zhì)量增加近0.015 g/mL。隨后繼續(xù)培養(yǎng)12～132 h，期間菌體生長明顯趨于平穩(wěn)，呈緩慢增加的趨勢。完全適應PDB生長環(huán)境的冠突散囊菌，經(jīng)過前12 h菌體的大量繁殖，冠突散囊菌菌體干質(zhì)量大大增加，使得PDB培養(yǎng)體系內(nèi)菌體相對密度大大增加，菌體生長空間相對變小。培養(yǎng)到132～156 h時可見菌體生長速率大幅提升，并且156 h菌絲體干質(zhì)量達到最大為0.058 g/mL，可知此階段為冠突散囊菌活力最旺盛的時期。到168 h時，菌絲體干質(zhì)量略微減少（0.002 g/mL），可能是由于菌絲體自溶造成[35]。

圖3 HNYYWX.13冠突散囊菌培養(yǎng)過程中菌絲體干質(zhì)量變化Fig. 3 Change in dry biomass yield of E. cristatum HNYYWX.13 during incubation

2.3 冠突散囊菌形態(tài)特征

圖4 HNYYWX.13冠突散囊菌的形態(tài)特征Fig. 4 Morphological characteristics of E. cristatum HNYYWX.13

將分離得到的冠突散囊菌接種到PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)，約48 h冠突散囊菌開始生長，首先長出白色菌絲體向外延伸，菌落中心逐漸由白色變?yōu)闇\黃色，圖4A為冠突散囊菌生長2 d的形態(tài)。圖4B中，黃色閉囊殼產(chǎn)生在整個菌落區(qū)域內(nèi)，菌落直徑達到7～10 mm，呈淡黃色，第5天時菌落直徑18～20 mm，菌落邊緣呈淡黃色，中心凸起，越靠近菌落中心顏色依次變深呈黃色、深黃色，菌落中心顏色深至橄欖褐色或深褐色，并且菌落中心有少許黃色透明小液珠滲出。菌落生長7 d時，直徑達到25～30 mm，菌落背部有大量色素滲出，擴散進入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)深褐色。約12 d，能夠很明顯觀察到菌落中心有干澀、凸起褶皺，菌落直徑達40～45 mm。圖4C為冠突散囊菌生長19 d形態(tài)，此時菌落直徑達50～55 mm，基本不再變化，顏色全部呈現(xiàn)褐色，分泌出的色素使整個培養(yǎng)基呈黑褐色。

圖4D中孢子梗簇擁，菌絲體交錯（紅色橢圓）。圖4E觀察到單個子囊果為橢球狀（紅色方框）及向外發(fā)散的菌絲體（紅色橢圓）。

通過電鏡觀察，冠突散囊菌能產(chǎn)生大量閉囊殼（圖4F），纏繞在菌絲中，呈球形或近球形，直徑為750～950 μm。子囊球形或近球形，由擬薄壁組織包裹子囊孢子，隨著子囊孢子的發(fā)育，擬薄壁組織逐漸溶解漏出球狀體的子囊孢子，直徑約26～32 μm，圖4G為大量散落的子囊孢子。隨著子囊孢子的進一步發(fā)育，如圖4H、I所示，整個子囊孢子呈“雙花”狀，子囊孢子呈雙凸透鏡形，“赤道”（4I圖中紅色標記）部分具有兩條明顯的縱向雞冠狀“脊”，較薄，反卷，赤道溝較深。

2.4 冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵

2.4.1 滅菌處理對發(fā)酵過程中主要理化指標的影響

圖5 發(fā)酵過程中茶多酚總量的變化Fig. 5 Changes in tea polyphenol content during liquid-state fermentation

茶多酚是茶葉發(fā)酵過程中菌體生長的主要碳源，通過冠突散囊菌的代謝調(diào)控，可將茶葉中的茶多酚轉(zhuǎn)化為小分子的功能性成分[11,34]，如兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、茶黃素[35-36]、茯茶素等，使茶多酚總量減少，由圖5可知，接種冠突散囊菌的發(fā)酵液中，茶多酚總量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸減少，對于浸提液直接發(fā)酵過程，茶多酚總量由15.09%減少到10.32%；浸提液滅菌后發(fā)酵，茶多酚總量由14.32%減少到11.64%。前者發(fā)酵過程，冠突散囊菌利用了更多的茶多酚，大大促進了新的代謝產(chǎn)物的生成。正如文獻[37]通過冠突散囊菌調(diào)控，經(jīng)過氧化、縮合等作用生成了更多種類的功能產(chǎn)物，如：茯茶素A和茯茶素B[38]、異戊二烯衍生物[39]、三萜烯類化合物[40]、7 種B環(huán)裂解兒茶素（黃烷-3-醇）衍生物[8]以及其他未解析清楚的未知化合物[41]；許杰等[42]研究表明冠突散囊菌發(fā)酵過程中，表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯氧化縮合形成茶黃素，茶黃素進一步氧化、與氨基酸、蛋白質(zhì)等縮合成形成茶紅素等功能性成分。配對t檢驗分析表明，滅菌后發(fā)酵與直接發(fā)酵，茶多酚總量存在極顯著差異（P=0.002＜0.01）。此外，滅菌處理前，發(fā)酵液中茶多酚總量為15.09%，而滅菌處理后茶多酚總量減少為14.32%，說明滅菌處理會破壞大量的茶多酚，對茶葉自身營養(yǎng)有很大損失；發(fā)酵過程中，浸提液直接發(fā)酵轉(zhuǎn)化近5%的茶多酚，而滅菌處理后發(fā)酵僅轉(zhuǎn)化約3%的茶多酚，表明浸提液直接接種冠突散囊菌發(fā)酵，可產(chǎn)生更多具有生物活性的小分子物質(zhì)，更有利于豐富發(fā)酵茶湯的品質(zhì)。

圖6 發(fā)酵過程中氨基酸總量的變化Fig. 6 Changes in amino acid content during liquid-state fermentation

由圖6可知，接種冠突散囊菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中氨基酸總量呈上升趨勢，說明冠突散囊菌的代謝產(chǎn)生了大量氨基酸。研究[25]報道，接種冠突散囊菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中會產(chǎn)生多種豐富的氨基酸，如人體必需氨基酸：賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等。發(fā)酵前約48 h，冠突散囊菌逐漸適應生長環(huán)境。隨后，菌體生長比較穩(wěn)定，開始代謝產(chǎn)生各種氨基酸。顯然，浸提液直接發(fā)酵所得發(fā)酵液中氨基酸總量較滅菌處理更高。配對t檢驗分析表明，滅菌后發(fā)酵與直接發(fā)酵，氨基酸總量存在極顯著差異（P=0.000＜0.01）。因此不滅菌處理比傳統(tǒng)滅菌處理發(fā)酵效果更好。

2.4.2 碳源對發(fā)酵過程中主要理化指標的影響

由圖7、8可知，兩種處理方式下，發(fā)酵液中茶多酚總量降低，氨基酸總量升高，其中發(fā)酵前期氨基酸總量升高可能是由于冠突散囊菌的調(diào)控代謝生成，發(fā)酵后期可能由于冠突散囊菌菌絲體自溶釋放氨基酸到發(fā)酵液中[16]。添加碳源后發(fā)酵，48～108 h茶多酚減少速率明顯快于不添加碳源，正如文獻報道，蔗糖誘導冠突散囊菌“發(fā)花”[14]，其生長繁殖速度大大加快，利用發(fā)酵液中大量的茶多酚，將其轉(zhuǎn)化為小分子功能性成分，大大發(fā)揮冠突散囊菌代謝產(chǎn)物的生物活性功能（圖7），所以添加碳源有利于茶多酚轉(zhuǎn)化；如圖8所示，兩種處理方式下，發(fā)酵過程中氨基酸總量均呈上升趨勢且氨基酸生成量基本一樣，所以碳源對冠突散囊菌發(fā)酵過程中氨基酸總量影響不大。配對t檢驗分析表明，添加碳源與未添加碳源發(fā)酵過程中，茶多酚總量和氨基酸總量均存在極顯著差異（P=0.000＜0.01）。綜合兩種指標，添加碳源更有利于冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵。

圖7 碳源作用下發(fā)酵過程中茶多酚總量的變化Fig. 7 Changes in tea polyphenol content during fermentation with and without addition of carbon source

圖8 碳源作用下發(fā)酵液中氨基酸總量的變化Fig. 8 Changes in amino acids during fermentation with and without addition of carbon source

3 結(jié) 論

以湖南益陽手筑茯磚茶為研究對象，通過分離純化、PCR、基因測序的手段鑒定得到8 株序列相似度為99%的冠突散囊菌，1 株編號為HNYYWX.13序列相似度為100%的冠突散囊菌；對菌株HNYYWX.13進行菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察，并探究得到其生長曲線，培養(yǎng)到132～156 h時菌體生長速率大幅提升，156 h菌絲體干質(zhì)量達到最大為0.058 g/mL，此階段為冠突散囊菌活力最旺盛的時期；選取菌株HNYYWX.13制備孢子懸浮液接種于平利山茶（夏秋茶）浸提液中液態(tài)發(fā)酵，研究了滅菌處理、添加碳源對冠突散囊菌發(fā)酵下茶多酚總量及氨基酸總量的影響，得出結(jié)論：添加碳源、不進行滅菌處理更有利于冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵。

本研究探索了冠突散囊菌在平利山茶液態(tài)發(fā)酵中的應用潛力，避免其固態(tài)發(fā)酵過程中條件不易控制、不宜規(guī)?；a(chǎn)的缺陷，利用我國浪費最嚴重的夏秋茶，大大提高了茶資源利用率，并且提出傳統(tǒng)茶水浸提液滅菌后發(fā)酵的誤區(qū)，指出不進行滅菌處理更有利于冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵，為其工業(yè)化生產(chǎn)及茶產(chǎn)品的深加工技術(shù)提供了可行性路徑。但是關于冠突散囊菌在液態(tài)發(fā)酵中代謝機制還需進一步研究，這對于深入揭示冠突散囊菌多種保健功效具有重要意義。