普魯蘭生物合成中底物的作用及其生理機制

朱燦燦，陳 晨，王大慧，衛(wèi)功元*

（蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123）

普魯蘭是一種由α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位經(jīng)α-1,6-糖苷鍵聚合而成的水溶性直鏈微生物多糖[1-2]。普魯蘭安全無毒，具有可塑性、成膜性、吸附性以及耐熱、耐鹽和耐酸堿等優(yōu)良特性，因此，在食品加工、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用前景[3-7]。

作為一種高分子聚合物，普魯蘭大多是由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）在好氧條件下利用簡單糖類物質(zhì)合成并分泌到胞外的[8]。在普魯蘭的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，多糖的產(chǎn)量和分子質(zhì)量是兩個重要的過程參數(shù)，前者的大小主要取決于前體物質(zhì)的供給以及出發(fā)菌株合成普魯蘭的能力，而后者則與普魯蘭的降解密切相關(guān)[9]。出芽短梗霉胞內(nèi)的α-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（α-phosphoglucose mutase，PGM）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGP）和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，F(xiàn)KS）是普魯蘭合成代謝途徑中的3 個關(guān)鍵酶，是控制普魯蘭能否實現(xiàn)高效合成的瓶頸因素[10]；胞外的普魯蘭降解酶（包括α-淀粉酶和普魯蘭酶等）主要參與普魯蘭的降解反應(yīng)，最終影響到普魯蘭的分子質(zhì)量[11-12]，而分子質(zhì)量的大小又將決定普魯蘭的應(yīng)用范圍[13]。

在普魯蘭的生物合成過程中，前體物質(zhì)尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）和能量物質(zhì)ATP的供給與消耗速率是影響普魯蘭產(chǎn)量和合成效率的關(guān)鍵因素，而胞內(nèi)UDPG和ATP含量均與底物的種類和水平密切相關(guān)[14-15]。出芽短梗霉能利用多種簡單糖類物質(zhì)（如葡萄糖、蔗糖和木糖等）作為底物合成普魯蘭[2]。Sheng Long等[16]通過對胞內(nèi)呋喃果糖苷酶的活性進行檢測，認為蔗糖是實現(xiàn)普魯蘭高產(chǎn)較為理想的底物；薛文嬌等[17]運用發(fā)酵動力學模型探討了不同蔗糖質(zhì)量濃度下普魯蘭發(fā)酵過程中的細胞生長、多糖合成和底物消耗的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)采用50 g/L蔗糖補料分批發(fā)酵比分批發(fā)酵更為高效；Chen Yefu等[18]通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高了由木糖和半纖維素水解液生物合成普魯蘭的產(chǎn)量和效率。然而，截至目前，鮮有針對出芽短梗霉利用不同糖類物質(zhì)合成普魯蘭生理機制的研究報道。為此，本研究考察不同底物條件對普魯蘭分批發(fā)酵產(chǎn)量和分子質(zhì)量的影響，并從發(fā)酵動力學、關(guān)鍵酶活性以及胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝等角度對普魯蘭生物合成的生理生化機制進行解析，研究結(jié)果將為具有不同應(yīng)用潛力的普魯蘭的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A. pullulans CCTCC M 2012259由蘇州大學微生物生理與代謝調(diào)控研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖（或蔗糖，或木糖）100 g/L，酵母粉3 g/L，(NH4)2SO40.6 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 3.8。

磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測試盒 上海皓塵生物科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測試盒 上海將來實業(yè)股份有限公司；所有試劑均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BIOTECH-5BGZ攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；LD5-2A離心機 北京京立離心機有限公司；1525高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SW-CJ-2A超凈工作臺 吳江市龍宏凈化設(shè)備有限公司；HZ-2010K恒溫搖瓶柜 太倉市華利達實驗儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KB滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接種入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.2 分批培養(yǎng)

按照10%（V/V）的接種量將種子接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在30 ℃、400 r/min和3 L/min通氣量的條件下進行分批培養(yǎng)。pH值采用梅特勒電極在位監(jiān)測，并通過自動流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為3.8±0.02。

1.3.3 細胞干質(zhì)量與普魯蘭產(chǎn)量測定

取20 mL發(fā)酵液，80 ℃水浴15 min滅活，冷卻至室溫后在12 000 r/min離心10 min。沉淀用蒸餾水洗滌3 次，收集細胞后于70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，計算得到細胞干質(zhì)量；取離心后的上清液10 mL，加入2 倍體積無水乙醇，4 ℃處理12 h，12 000 r/min離心10 min，將沉淀于70 ℃烘干至質(zhì)量恒定，計算得到普魯蘭產(chǎn)量。

1.3.4 無細胞提取物的制備

取5 mL發(fā)酵液，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌2 次后，將濕細胞重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，超聲破碎10 min（破碎10 s，間隔10 s），在4 ℃、12 000 r/min離心20 min后得到的上清液即為無細胞提取物，用于測定胞內(nèi)物質(zhì)含量和關(guān)鍵酶活性。

1.3.5 指標測定

發(fā)酵液中葡萄糖和木糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[19]；蔗糖先用6 mol/L鹽酸在沸水中處理10 min，然后采用DNS法進行測定；普魯蘭分子質(zhì)量的測定采用黏度法[20]。

胞內(nèi)UDPG含量采用HPLC法進行測定[21]。色譜柱為Supelcosil LC-18-DB柱（4.6 mm×250 mm），流動相為40 mmol/L三乙胺-乙酸緩沖液（pH 6.0），流速1 mL/min，柱溫22 ℃，檢測波長254 nm。

胞內(nèi)NADH和ATP的測定采用HPLC法[15]。

1.3.6 酶活性測定

普魯蘭合成能力測定采用全細胞轉(zhuǎn)化法[22]。取5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，將濕細胞重懸于5 mL轉(zhuǎn)化液（5 g/L葡萄糖，0.2 g/L MgSO4·7H2O，pH 6.0）中，然后在30 ℃、200 r/min搖床中轉(zhuǎn)化3 h。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，檢測生成的普魯蘭含量。

普魯蘭降解酶系活性測定[23]。取5 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，將上清液與普魯蘭標準品混合后于50 ℃水浴鍋中保溫反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，立即在100 ℃加熱終止反應(yīng)，測定反應(yīng)前和反應(yīng)后上清液中還原糖的濃度。在50 ℃條件下，將每分鐘釋放1 μmol還原糖所參與普魯蘭降解的酶量定義為1 個酶活單位（U）。

PGM活性：采用磷酸葡萄糖變位酶聯(lián)免疫分析測試盒進行測定；UGP活性：采用尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶聯(lián)免疫分析測試盒進行測定，具體操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行；FKS活性：測定方法參見文獻[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有分批發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)均為3 次檢測結(jié)果的平均值。Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同底物對普魯蘭分批發(fā)酵的影響

圖1 不同底物條件下的細胞生長和普魯蘭分批發(fā)酵過程Fig. 1 Time-course curve of cell growth and pullulan production using different sugars as substrates

不同底物（葡萄糖、蔗糖和木糖）條件下的A. pullulans CCTCC M 2012259細胞生長、普魯蘭生物合成以及分子質(zhì)量的變化情況如圖1所示?？梢钥闯?，出芽短梗霉細胞能夠很好地利用3 種糖進行生長并合成普魯蘭，細胞干質(zhì)量和普魯蘭產(chǎn)量分別在72 h和120 h時達到最大值，而普魯蘭最大分子質(zhì)量則出現(xiàn)在18 h。此外，細胞利用單糖（葡萄糖和木糖）比利用蔗糖時具有更高的生長速率。然而，在發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源供給一定的情況下，3 種糖作為碳源時的最終細胞干質(zhì)量沒有顯著差異。

表1 不同底物條件下的普魯蘭分批發(fā)酵動力學參數(shù)Table 1 Fermentation kinetic parameters using different sugars as substrates

與細胞生長不同的是，底物對普魯蘭生物合成具有較大的影響。利用蔗糖可以獲得更高的普魯蘭合成速率和產(chǎn)量，最終普魯蘭產(chǎn)量比利用葡萄糖和木糖時分別提高了15.5%和19.1%；而利用葡萄糖更有利于獲得較高的分子質(zhì)量，普魯蘭的最大分子質(zhì)量和最終分子質(zhì)量（120 h）均高于利用蔗糖和木糖時的水平。此外，與已有研究[15]相比，初糖質(zhì)量濃度為100 g/L時的普魯蘭得率和生產(chǎn)強度均處于較高的水平（表1）。綜合普魯蘭分批發(fā)酵過程（圖1）以及其他動力學參數(shù)（表1）結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，蔗糖有利于獲得更高的普魯蘭產(chǎn)量而葡萄糖有助于維持更高的普魯蘭分子質(zhì)量。以下將分別從關(guān)鍵酶活性以及物質(zhì)和能量代謝的角度對不同底物影響普魯蘭生物合成的生理機制進行探討。

2.2 普魯蘭合成能力和降解酶活性

在分批發(fā)酵過程中，普魯蘭生物合成速率的高低由胞內(nèi)合成酶系的能力決定[22]，而普魯蘭分子質(zhì)量的大小則與胞外的降解酶系活性密切相關(guān)[15,23]。為此，分別測定分批發(fā)酵前期出芽短梗霉細胞的普魯蘭合成能力和發(fā)酵后期降解酶活性，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，無論細胞利用何種糖作為碳源，發(fā)酵前期（18 h）的細胞均具有更高的普魯蘭合成能力，而發(fā)酵后期（72 h）的胞外普魯蘭降解酶系具有更高的活性。與此同時，相較于葡萄糖和木糖，蔗糖不僅提高了普魯蘭的合成能力，而且也提升了胞外普魯蘭降解酶系的活性。

圖2 不同底物條件下的普魯蘭合成能力和降解酶系活性Fig. 2 Pullulan biosynthesis and pullulan-degrading activity with different substrates

2.3 普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性

圖3 不同底物條件下的普魯蘭合成關(guān)鍵酶活性Fig. 3 Key enzymes activities involved in pullulan biosynthesis with different substrates

PGM、UGP和FKS是普魯蘭生物合成途徑中的3 種關(guān)鍵酶，其活性大小與普魯蘭能否高效合成密切相關(guān)[10]。為此，對不同培養(yǎng)階段下的各關(guān)鍵酶活性進行測定，結(jié)果見圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)，不論細胞利用葡萄糖、蔗糖還是木糖，3 種關(guān)鍵酶均在發(fā)酵前期保持較高的活性，隨后逐漸下降。此外，在普魯蘭合成期（18、36 h），蔗糖存在下的PGM、UGP和FKS活性均高于葡萄糖和木糖；至72 h時，不同底物條件下的各關(guān)鍵酶活性差異不大。由此可見，蔗糖比葡萄糖和木糖更有利于將3 種關(guān)鍵酶活性維持在較高的水平，從而促進普魯蘭的生物合成。

2.4 胞內(nèi)UDPG水平

UDPG是普魯蘭生物合成的直接前體物質(zhì)[1,24]，胞內(nèi)UDPG水平是決定普魯蘭合成速率的關(guān)鍵因素。出芽短梗霉細胞進入普魯蘭合成期（36、72 h）時的胞內(nèi)UDPG含量見圖4?？梢钥闯?，細胞在利用葡萄糖、蔗糖和木糖合成普魯蘭時，胞內(nèi)UDPG在發(fā)酵前期（36 h）比后期（72 h）具有更高的水平。同時，細胞利用蔗糖后能將底物更多地轉(zhuǎn)化為UDPG并積累在胞內(nèi)，這為普魯蘭的進一步過量合成提供了更高的內(nèi)在驅(qū)動力。

圖4 不同底物條件下的胞內(nèi)UDPG含量Fig. 4 Levels of intracellular UDPG with different substrates

2.5 胞內(nèi)能量物質(zhì)水平

在普魯蘭生物合成過程中，除前體物質(zhì)UDPG以外，充足的能量供給也是普魯蘭過量合成的必要條件[15,25]。為此，測定不同培養(yǎng)階段出芽短梗霉細胞內(nèi)與能量代謝有關(guān)的輔因子NADH和ATP含量。圖5表明，在快速生長期（18 h），細胞利用葡萄糖和蔗糖后胞內(nèi)NADH和ATP含量明顯高于利用木糖的結(jié)果；至36 h時，利用蔗糖的細胞其胞內(nèi)NADH和ATP含量最高；而在72 h時，胞內(nèi)NADH和ATP含量均處于較低水平。由此可見，在普魯蘭合成期，蔗糖可提供比葡萄糖和木糖更多的能量物質(zhì)，以保障普魯蘭過量合成對ATP的需求。

圖5 不同底物條件下的胞內(nèi)NADH和ATP含量Fig. 5 Levels of intracellular NADH and ATP with different substrates

3 討 論

目前已經(jīng)有不少關(guān)于出芽短梗霉細胞利用不同糖類物質(zhì)作為底物合成普魯蘭的文獻報道[26-29]。然而，普魯蘭的合成是一個復(fù)雜的生物過程，相關(guān)生理生化機制至今仍未完全搞清楚[1,16]。普魯蘭的合成效率、產(chǎn)量以及分子質(zhì)量等指標會隨著底物的不同而發(fā)生變化[2,6]，但是鮮有研究對這些差異產(chǎn)生的原因進行探索。為此，本實驗研究底物對普魯蘭分批發(fā)酵的影響，重點對蘊含在其中的生理機制進行解析。

首先，根據(jù)普魯蘭的生物合成代謝途徑，發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)經(jīng)出芽短梗霉細胞代謝，在PGM和UGP的作用下形成前體物質(zhì)UDPG，然后UDPG在FKS的作用下形成麥芽三糖，最后再在FKS的作用下跨膜聚合形成普魯蘭[30-31]。因此，在底物糖類物質(zhì)充足的前提下，提高PGM和UGP活性有助于加快UDPG的合成速率；同時，較高的胞內(nèi)UDPG水平和FKS活性也更有利于提高普魯蘭的合成速率，并最終提高普魯蘭產(chǎn)量[24]。本研究結(jié)果表明，出芽短梗霉細胞在利用蔗糖時具有更高的PGM、UGP和FKS活性，胞內(nèi)UDPG水平更高，體現(xiàn)出細胞具有更強的普魯蘭合成能力，因此在底物濃度相同的情況下，可以獲得更高的普魯蘭產(chǎn)量。葡萄糖和木糖也可以直接用于合成普魯蘭，然而其關(guān)鍵酶活性和前體物質(zhì)含量均低于利用蔗糖時的水平。

其次，作為一種微生物多糖，分子質(zhì)量是普魯蘭這種聚合物的重要特征之一，而分子質(zhì)量的大小也是影響普魯蘭應(yīng)用范圍的主要因素[32]。有研究報道，在發(fā)酵后期普魯蘭分子質(zhì)量的降低與普魯蘭降解酶系活性有關(guān)[22]。Manitchotpisit等[12]將普魯蘭在合成過程中的降解歸功于細胞分泌的α-淀粉酶或普魯蘭酶，這種過程的最終結(jié)果不是普魯蘭的完全降解，而是普魯蘭長鏈中的小部分α-1,4-或α-1,6-糖苷鍵發(fā)生斷裂，導致普魯蘭分子質(zhì)量的降低。由于分批發(fā)酵過程中α-淀粉酶和普魯蘭酶活性較低[33]，很難獲得準確數(shù)據(jù)，因此常用普魯蘭降解酶系的活性來表示[23]。本研究結(jié)果表明，在葡萄糖存在的情況下，普魯蘭降解酶系的活性一直處于相對較低的水平；而蔗糖和木糖則有利于提高降解酶系的活性，普魯蘭在降解酶的作用下，最終的分子質(zhì)量均低于利用葡萄糖時的水平。由此可見，蔗糖有利于提高普魯蘭產(chǎn)量和得率，但葡萄糖卻有助于將普魯蘭分子質(zhì)量維持在較高水平。

此外，在普魯蘭生物合成中，ATP是不可或缺的能量物質(zhì)。Taguchi等[14]報道過在不添加ATP的情況下，無細胞酶液無法利用底物在胞外合成普魯蘭。在好氧發(fā)酵條件下，胞內(nèi)ATP是由NADH經(jīng)氧化磷酸化過程合成的，因此胞內(nèi)NADH含量及其轉(zhuǎn)化速率將直接影響到ATP的供給效率[15]。本研究中胞內(nèi)NADH和ATP含量測定結(jié)果表明，出芽短梗霉細胞在利用蔗糖和葡萄糖時，胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)的水平相對較高，特別是在普魯蘭快速合成期更為顯著，這為普魯蘭的過量合成提供了充足的能量保障。而木糖作為一種五碳糖，在其參與普魯蘭合成之前，需要經(jīng)歷較長的代謝途徑并消耗一定的能量[18]，因此胞內(nèi)NADH和ATP含量一直處于較低的水平，最終降低了普魯蘭的合成速率和產(chǎn)量。

綜上，考察葡萄糖、蔗糖和木糖3 種底物對普魯蘭分批發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)蔗糖有利于普魯蘭的高產(chǎn)而葡萄糖有助于獲得更高的分子質(zhì)量。在分析發(fā)酵動力學參數(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合關(guān)鍵酶活性以及胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝水平，部分解析了不同底物影響普魯蘭生物合成的生理生化機制。研究結(jié)果增加了對普魯蘭產(chǎn)量和分子質(zhì)量影響因素的認識，同時也為深入探究不同分子質(zhì)量普魯蘭的高產(chǎn)提供思路。