銀杏內酯是銀杏葉的主要活性成分,其中以銀杏內酯B活性最高,秦兵等[1-3]研究發(fā)現銀杏內酯B通過抑制細胞凋亡進而對腦組織、肝臟缺血再灌注損傷起到一定抑制作用。本研究探討銀杏內酯B對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響,現報道如下。
1.1 實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠,體質量240~260 g,由河北省實驗動物中心提供[SCXK(冀)2013-1-003],合格證號:201704002。
1.2 實驗藥物與試劑 銀杏內酯B購自美國Sigma公司(批號:33570);末端標記法(TUNEL)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:161008);凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3)多克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司(批號:201612013、201608010、201707009)。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組、模型制備與給藥 采用隨機數字表法將100只SD大鼠隨機分為假手術組(0.9%氯化鈉溶液)、模型組(0.9%氯化鈉溶液)及銀杏內酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組20只。其中銀杏內酯B中劑量(30 mg/kg)組根據人給藥劑量換算而來,另設低劑量組(15 mg/kg)和高劑量組(60 mg/kg)。模型制備[4]:腹腔注射1.2%烏拉坦實施麻醉后,連接心電圖進行心電監(jiān)測,取仰臥位、剝離氣管并插管、連接動物呼吸機,開胸并剝離左冠狀動脈,夾閉前降支,心電圖示ST段抬高或T波高聳為心肌缺血;30 min后松開動脈夾恢復冠狀動脈前降支血流灌注,ST段或T波恢復提示心肌再灌注成功。除不夾閉血管外,假手術組操作同模型組。各組每日1次腹腔注射給予相應濃度藥物,模型組和假手術組給予0.9%氯化鈉溶液,療程7 d。
1.3.2 心肌梗死體積計算 各組隨機取6只大鼠,麻醉后開胸取心臟組織,置-20 ℃冰箱凍存0.5 h,之后進行心臟組織切片,取厚度2 mm,浸入37 ℃恒溫濃度1%的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液,避光孵育0.5 h,每5 min翻動切片一次使之均勻著色。染色后灰白色為心肌梗死區(qū),紅色為正常組織,拍照后應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算心肌梗死體積。
1.3.3 蘇木精-伊紅(HE)染色法進行心肌組織病理學檢查及TUNEL法觀察心肌細胞凋亡 各組隨機取6只大鼠,取心臟組織后置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h,之后經切片、脫蠟、HE染色、脫水、封片等處理后,通過光學顯微鏡觀察心肌組織細胞形態(tài)結構改變。取石蠟切片,按照TUENL試劑盒方法步驟處理后,通過光學顯微鏡觀察心肌細胞凋亡狀態(tài),顯微鏡下計算視野內細胞總數和凋亡細胞數,每張切片隨機取5個不重疊的視野,分別取細胞總數和凋亡細胞數平均值,計算凋亡指數(AI):AI(%)=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。
1.3.4 免疫蛋白印跡法檢測蛋白表達 取各組剩余8只大鼠,麻醉后開胸取心臟并剪取心室部位,剪碎后加入9倍量蛋白裂解液,冰水浴中研磨勻漿,低溫(4 ℃)12 000 r/min離心15 min處理,蛋白質定量(BCA)法行蛋白定量后實施高溫蛋白變性,電泳。待溴酚藍接近膠底部時停止、轉膜、春紅溶液染色,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3、β-actin(1∶500)4 ℃過夜;洗膜,二抗(1∶100)室溫搖床上孵育1 h后經增強化學發(fā)光法(ECL)顯色。根據條帶灰度值,以β-actin為內參半定量分析Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達。
2.1 各組大鼠心電監(jiān)測結果 除假手術組外,其余各組大鼠造模過程,夾閉左冠狀動脈前降支后左心室前壁呈灰白而后逐漸呈現發(fā)紺癥狀,心電圖示ST段抬高或T波高聳,30 min后松開動脈夾恢復前降支血流,提示造模成功。與模型組比較,經銀杏內酯B治療7 d后,缺血再灌注損傷大鼠心電圖波形明顯改善,其中銀杏內酯B高劑量組心電波形基本恢復正常。詳見圖1。
A為假手術組;B為模型組;C為銀杏內酯B低劑量組;D為銀杏內酯B中劑量組;E為銀杏內酯B高劑量組
圖1各組大鼠心電圖
2.2 各組大鼠心肌梗死體積比較 模型組大鼠心肌組織梗死體積較假手術組顯著升高(44.8±5.9)%與(0.0±0.0)%,P<0.01;銀杏內酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組梗死體積分別為(40.1±7.3)%、(31.7±6.0)%、(22.3±4.5)%,與模型組比較,銀杏內酯B中劑量組、高劑量組心肌梗死體積顯著降低(P<0.05或P<0.01)。
2.3 各組大鼠心肌組織病理學檢查結果 與假手術組比較,模型組心肌組織肌原纖維斷裂,細胞排列紊亂,部分細胞出現空泡變性,胞漿著色不均,胞核固縮、深染、界限不清等病理性改變;與模型組比較,銀杏內酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組上述病理性改變呈不同程度改善,以銀杏內酯B高劑量組效果最顯著。詳見圖2。
A為假手術組;B為模型組;C為銀杏內酯B低劑量組;D為銀杏內酯B中劑量組;E為銀杏內酯B高劑量組
圖2各組大鼠心肌組織形態(tài)(HE,×200)
2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡狀況 與模型組比較,銀杏內酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組凋亡細胞數量明顯減少,以高劑量組最為顯著。模型組心肌細胞AI較假手術組顯著升高[(57.4±9.8)%與(0.0±0.0)%,P<0.01];銀杏內酯B低劑量組、中劑量組、高劑量組AI分別為(44.9±8.5)%、(38.9±7.4)%、(26.4±6.1)%,與模型組比較,銀杏內酯B中劑量組、高劑量組AI顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3。
A為假手術組;B為模型組;C為銀杏內酯B低劑量組;D為銀杏內酯B中劑量組;E為銀杏內酯B高劑量組
圖3各組大鼠心肌細胞凋亡狀況(TUNEL,×400)
2.5 各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達 與假手術組比較,模型組大鼠Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3顯著上調、且Bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,銀杏內酯B中劑量組、高劑量組Bcl-2表達上調(P<0.05或P<0.01);Bax、激活型Caspase-3下調(P<0.05或P<0.01),Bcl-2/Bax升高(P<0.01)。詳見圖4和表1。
A為假手術組;B為模型組;C為銀杏內酯B低劑量組;D為銀杏內酯B中劑量組;E為銀杏內酯B高劑量組
圖4各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達
表1 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3蛋白表達(±s)
與假手術組比較,1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較,3)P<0.05,4)P<0.01
目前,及時溶栓實現血流恢復灌注是急性心肌梗死(AMI)的主要治療方案,再灌注損傷嚴重影響AMI預后。既往多項研究表明,心功能異常、氧化應激損傷、炎癥反應及繼發(fā)性心肌細胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理機制[5-9]。
本研究通過結扎左冠狀動脈前降支方法制作缺血再灌注損傷大鼠模型,該造模方法操作簡單、成功率高且與臨床AMI癥狀接近,是常用的造模方法[10]。本研究結果顯示:銀杏內酯B治療能改善心電圖波形,抑制心肌組織細胞病變和細胞凋亡,減小梗死體積,說明銀杏內酯B可抑制心肌缺血再灌注損傷。
激活型Caspase-3在細胞凋亡啟動及后續(xù)過程中均發(fā)揮重要作用[11];Bcl-2通過抑制Caspase-3激活、阻止細胞色素C釋放、降低細胞內鈣濃度從而表現出抑凋亡作用[12];Bax通過破壞線粒體滲透性、激活Caspase-3表現出促凋亡作用[13];且Bax與Bcl-2聚合成二聚體相互抑制活性,因此,Bax/Bcl-2比值能實現二者對細胞凋亡的調控作用[14]。本研究結果顯示:經銀杏內酯B治療心肌缺血再灌注能上調抑凋亡Bcl-2表達,下調促凋亡Bax和激活型Caspase-3表達,提高Bcl-2/Bax比值,這可能是銀杏內酯B抑制細胞凋亡的重要分子機制。
綜上所述,銀杏內酯B通過調節(jié)凋亡相關蛋白表達,從而抑制再灌注損傷后心肌細胞凋亡。