鹿紅方對(duì)氧糖剝奪模型心臟干細(xì)胞自噬和抗凋亡能力的影響

心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)移植治療缺血性心肌病具有廣闊的應(yīng)用前景，但移植細(xì)胞的高凋亡率是影響干細(xì)胞療法療效的重要原因。如何提高干細(xì)胞在缺血、缺氧環(huán)境的生存率成為目前研究的熱點(diǎn)。干細(xì)胞領(lǐng)域相關(guān)研究顯示，在多種應(yīng)激狀態(tài)下，適當(dāng)自噬可提高干細(xì)胞抗凋亡能力[1-3]。多種化學(xué)物質(zhì)通過(guò)改善應(yīng)激狀態(tài)下干細(xì)胞自噬，可提高細(xì)胞抗凋亡能力[4]。本研究探討中藥復(fù)方鹿紅方(LHF)對(duì)氧糖剝奪模型CSCs自噬和CSCs抗凋亡能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 CSCs及實(shí)驗(yàn)藥物 CSCs購(gòu)自Lonza公司；鹿紅方由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑室提供，由鹿角片、紅花、仙靈脾、補(bǔ)骨脂、女貞子、山萸肉、沉香按15∶9∶30∶20∶15∶30∶6 比例配制。鹿紅方水提物制備方法如下：將藥材置不銹鋼鍋中，加適量水浸泡1 h，置于電磁爐上，先用大火煮沸后，再用小火保持微沸煎煮1 h，18層紗布過(guò)濾，濾液備用；另外再加適量水同法再煎煮1次，18層紗布濾過(guò)，合并兩次藥液，于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，在60 ℃真空干燥，干膏稱重，再碾為均勻細(xì)粉，備用。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、無(wú)血清培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購(gòu)自上海易色公司；自噬抑制劑3-MA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；GAPDH抗體購(gòu)自天津三箭公司；Beclin-1、LC3-Ⅱ兔抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 三氣培養(yǎng)箱購(gòu)自日本松下公司；水浴恒溫?fù)u床購(gòu)自上海漢諾公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；超凈臺(tái)，購(gòu)自美國(guó)BioX公司；多功能酶標(biāo)儀T0-3型購(gòu)自瑞士Tecan公司；-80 ℃冰箱購(gòu)自日本Sanyo公司。

1.2 CSCs氧糖剝奪模型制備 氧糖剝奪模型制備參考Wohnsland 等[5]報(bào)道方法并加以改進(jìn)，簡(jiǎn)述如下：取1 mL凍存CSCs(1～10)×107，常規(guī)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基，并置于37 ℃三氣培養(yǎng)箱中，設(shè)置氣體比例：N2∶CO2為95%∶5%。將此混合氣體以流速10 L/min通過(guò)三氣培養(yǎng)箱，至測(cè)氧儀檢測(cè)箱中氧氣體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)停止通氣。氧糖剝奪持續(xù)時(shí)間為1.5 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方式 將CSCs隨機(jī)分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))與氧糖剝奪造模組(缺血缺氧)。將造模組分為模型組(不予有效干預(yù)措施)、3-MA組(給予自噬阻斷劑)、LHF200組(給予LHF 200 μg/mL)和LHF200+3-MA組(給予LHF 200 μg/mL+自噬阻斷劑)。3-MA為自噬抑制劑，用于阻斷自噬過(guò)程。各組干預(yù)方式見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及造模和干預(yù)方式

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 光鏡及CCK-8法檢測(cè)CSCs活細(xì)胞數(shù)量 首先光鏡下觀察各組CSCs形態(tài)，之后將待測(cè)CSCs細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中(104細(xì)胞/孔)。加入CCK-8試劑10 μL，混勻后37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h，測(cè)定450 nm處OD值。酶標(biāo)儀讀取待測(cè)樣品和空白參照在450 nm處OD值。將各待測(cè)樣本OD值記為測(cè)量值，空白參照OD值作為空白值，終值=測(cè)量值-空白值；通過(guò)判定OD值反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.5.2 Western Blot檢測(cè)CSCs自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 采用Western blot法測(cè)定各組CSCs表達(dá)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ水平，測(cè)定方法按照相關(guān)研究[7]進(jìn)行，具體如下：蛋白用SDS-PAGE提取分離，然后轉(zhuǎn)膜至聚乙烯二氟膜上。孵育一抗，稀釋比如下：Beclin-2 1∶1 000；LC3-Ⅱ?yàn)?1∶100；過(guò)夜，室溫下孵育二抗1 h。最后采用灰度值半定量法分析蛋白表達(dá)量。

1.5.3 RT-PCR檢測(cè)CSCs自噬相關(guān)蛋白基因的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Beclin-1及LC3-Ⅱ基因表達(dá)。操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，按照相關(guān)研究[7]進(jìn)行，具體如下：應(yīng)用TRIzol法提取總RNA。用TRIzol RNA提取劑(Invitrogen)提取核酸蛋白復(fù)核物，核酸蛋白復(fù)合物經(jīng)氯仿抽取、異丙醇中沉淀，75%乙醇清洗及RNase-free水中純化后離心。將GAPDH表達(dá)水平作為內(nèi)控，以iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif)反轉(zhuǎn)錄總RNA。用XX amplification；根據(jù)目的基因序列信息設(shè)計(jì)并合成PCR檢測(cè)引物，序列見(jiàn)下表2。PCR條件如下：預(yù)變性95 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)，60 ℃下退火20 s，之后72 ℃下延伸20 s，樣本共進(jìn)行40次循環(huán)，SYBR Green法熒光定量PCR分析各基因表達(dá)，最后使用2-△△Ct法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量。

表2 RT-PCR檢測(cè)引物序列

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下各組CSCs形態(tài)觀察 正常組可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)目較多，形態(tài)呈較規(guī)則梭形，懸浮細(xì)胞少；模型組可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量較少，大部分細(xì)胞皺縮，懸浮細(xì)胞較多，提示大量細(xì)胞凋亡壞死；3-MA組與模型組接近；LHF200組與模型組及3-MA組比較，細(xì)胞密度上升，形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，皺縮細(xì)胞少，懸浮的凋亡細(xì)胞數(shù)較少，提示凋亡細(xì)胞減少；LHF200+3-MA組可見(jiàn)細(xì)胞凋亡較LHF200組增加。詳見(jiàn)圖1。

1為正常組；2為模型組；3為3-MA組；4為L(zhǎng)HF200組；5為L(zhǎng)HF200+3-MA組

2.2 CCK-8檢測(cè)各組CSCs活細(xì)胞OD值 對(duì)照組與各造模組CSCs活細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，各造模組CSCs活細(xì)胞OD值顯著降低，表明在氧糖剝奪模型下，細(xì)胞發(fā)生大量凋亡； LH200F組和模型組比較，CSCs活細(xì)胞OD值顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示鹿紅方可減少缺血缺氧狀態(tài)下CSCs凋亡；LHF200+3-MA組與LHF200組比較，CSCs活細(xì)胞OD值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。詳見(jiàn)表3。

表3 CCK-8檢測(cè)各組CSCs活細(xì)胞OD值(±s)

與對(duì)照組比較，1)P<0.001；與模型組比較，2)P<

0.01；與LHF 200組比較，3)P<0.05

2.3 Western Blot蛋白檢測(cè) 模型組與對(duì)照組比較，Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.001)，表明氧糖剝奪模型可促進(jìn)CSCs自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)；3-MA組與模型組比較，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)顯著降低(P<0.001)；LHF200組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)與模型組比較顯著降低(P<0.001)，顯著高于3-MA組和LHF200+3-MA組(P<0.001)。詳見(jiàn)圖2、圖3。

與對(duì)照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與3-MA組比較，△P<0.001

圖2各組Beclin-1蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001；與3-MA組比較，△P<0.001

圖3各組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)比較

2.4 RT-PCR基因表達(dá)檢測(cè) 與對(duì)照組比較，模型組Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.001)，表明氧糖剝奪模型可促進(jìn)CSCs自噬的發(fā)生，這與Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果一致；與模型組比較，3-MA組Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.001)，提示3-MA可阻斷自噬；LHF200組與模型組比較，Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.001)，提示LHF可調(diào)節(jié)CSCs缺血、缺氧應(yīng)激條件下自噬，防止過(guò)度自噬，這與Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果一致。詳見(jiàn)圖4、圖5。

與對(duì)照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001

與對(duì)照組比較，#P<0.001；與模型組比較，*P<0.001

3 討 論

自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身過(guò)多或有功能缺陷的細(xì)胞內(nèi)成分，從而維持細(xì)胞能量水平，更新胞質(zhì)成分的過(guò)程[8]。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)送溶酶體途徑不同，分為3種自噬：大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[9-10]。其中大自噬是主要的自噬形式(本研究提到的“自噬”均指大自噬)，在生理狀態(tài)下，機(jī)體存在一種程度較低的基礎(chǔ)狀態(tài)自噬，這種狀態(tài)通過(guò)降解損壞的細(xì)胞器和無(wú)用蛋白質(zhì)起到調(diào)控細(xì)胞存活、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用[11]。在病理狀態(tài)下，面對(duì)各種應(yīng)激，自噬對(duì)細(xì)胞存亡影響有兩種不同的觀點(diǎn)：一種認(rèn)為自噬的啟動(dòng)是細(xì)胞凋亡的前奏，主要起到加速細(xì)胞凋亡的作用[10]；另一種認(rèn)為，自噬是應(yīng)對(duì)外界刺激的保護(hù)性行為，及時(shí)清除部分壞死組織和不良代謝產(chǎn)物，從而為總體細(xì)胞存活提供機(jī)會(huì)[11]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提示，自噬的啟動(dòng)和發(fā)生程度與不同的應(yīng)激類型、持續(xù)時(shí)間和細(xì)胞種類相關(guān)[12]。應(yīng)激狀態(tài)下，一定程度的自噬，通過(guò)清掃損壞細(xì)胞器、循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)及消化聚集蛋白，從而阻止或減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)、DNA損傷和能量耗竭等導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。

干細(xì)胞領(lǐng)域相關(guān)研究顯示，在多種應(yīng)激下，自噬能提高干細(xì)胞抗凋亡能力[1-3]：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BM-MSCs)存在較高的基礎(chǔ)自噬狀態(tài)，應(yīng)用無(wú)血清環(huán)境誘導(dǎo)BM-MSCs可增強(qiáng)自噬，結(jié)果提示蛋白Bcl-2和Bcl-xL能刺激自噬體生成，促進(jìn)保護(hù)性自噬的發(fā)生，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)缺乏應(yīng)激下BM-MSCs存活能力；阿托伐他汀可激活自噬，從而減少低氧無(wú)血清應(yīng)激下BM-MSCs死亡，并應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑rapamycin驗(yàn)證自噬與抗細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系；自噬的增強(qiáng)對(duì)降低氧化應(yīng)激下BM-MSCs死亡率起重要作用?？梢?jiàn)適當(dāng)?shù)淖允捎欣谔岣連M-MSCs的存活率，而其是否亦能對(duì)CSCs的存活率產(chǎn)生影響，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加，提示缺血缺氧環(huán)境刺激細(xì)胞啟動(dòng)自噬；LHF200組自噬蛋白和其基因表達(dá)顯著高于3-MA組，低于模型組，免疫熒光結(jié)果與之一致，LHF200組細(xì)胞凋亡程度最低。提示LHF通過(guò)調(diào)節(jié)自噬降低缺血缺氧環(huán)境下CSCs凋亡率。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，自噬現(xiàn)象符合中醫(yī)正邪相爭(zhēng)理論，自噬是對(duì)機(jī)體正虛邪實(shí)做出的一種自我調(diào)節(jié)方式[14]；細(xì)胞自噬與機(jī)體臟腑功能低下，內(nèi)生痰濁、瘀血之實(shí)邪的自我清除以維持內(nèi)環(huán)境的陰陽(yáng)平衡及中醫(yī)氣虛情況下通過(guò)“精化氣”，維持機(jī)體生命活動(dòng)機(jī)制一致[15]。LHF以補(bǔ)腎活血法為治療大法，由鹿角片、紅花、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、山萸肉、女貞子和沉香組成。方中鹿角片溫補(bǔ)肝腎、補(bǔ)益精血，使腎氣有根，自然上通于心，紅花活血化瘀通經(jīng)兼涼血解毒，共為君藥；補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽(yáng)、納氣平喘，淫羊藿溫腎壯陽(yáng)，二藥共同協(xié)助鹿角溫補(bǔ)腎陽(yáng)，均為臣藥；山萸肉補(bǔ)益肝腎、收斂固澀，女貞子補(bǔ)益肝腎之陰，在方中含“陰中求陽(yáng)”之意，沉香溫腎納氣、降逆平喘，三藥共為佐使藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎活血之功效。有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血類方劑具有抑制卵巢顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬作用[16]；活血類方劑通過(guò)調(diào)節(jié)自噬活性，保護(hù)心肌細(xì)胞缺血損傷[17]。

綜上所述，補(bǔ)腎活血的LHF通過(guò)調(diào)節(jié)腎之真陰真陽(yáng)平衡，從而調(diào)節(jié)五臟陰陽(yáng)，通過(guò)活血理氣，增強(qiáng)CSCs抗凋亡能力。由于LHF調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的具體機(jī)制復(fù)雜，尚有較多問(wèn)題如自噬程度的調(diào)控機(jī)制，適當(dāng)自噬的標(biāo)準(zhǔn)等是今后深入研究的內(nèi)容。