丁香酚對高粱醇溶蛋白可食性膜結(jié)構(gòu)及性能的影響

唐 艷 胡 熠 周 偉 徐大倫 樓喬明 楊文鴿 張進杰

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院/浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211)

可食膜是以天然可食性生物大分子為主要成膜基質(zhì)，通過流延、吹塑、自然干燥等工藝，借助分子之間的相互作用而形成的一種具有一定力學(xué)性能和阻隔性能的薄膜[1]，能夠阻止溶質(zhì)、水分和氣體等的遷移，保持食品品質(zhì)，延長食品貨架期。目前，國內(nèi)外關(guān)于可食性膜材料的研究已有大量報道，如用糖類、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子制膜，其中玉米淀粉可降解購物袋[2]已經(jīng)完成工業(yè)生產(chǎn)，走進了人們的日常生活。而植物蛋白質(zhì)因具有安全無毒、生物相容性高及環(huán)境友好等特點，已成為制作新型可食性膜的優(yōu)選材料之一，如大麥醇溶蛋白膜[3]、大豆分離蛋白膜[4]、高粱醇溶蛋白膜[5]等。其中，高粱醇溶蛋白中含有較多的疏水性氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等)，在水中的溶解度低，制備的蛋白膜對水和氣體均具有良好的阻隔性能[6]。但單一的高粱醇溶蛋白膜較脆，塑性較差，限制了其在食品包裝領(lǐng)域中的應(yīng)用。為改善高粱醇溶蛋白膜的性能，Giteru等[7]在高粱醇溶蛋白膜中添加活性物質(zhì)檸檬醛和槲皮素，發(fā)現(xiàn)二者均可改善其性能；后來Giteru等[5]進一步將檸檬醛/槲皮素-高粱醇溶蛋白復(fù)合膜用于新鮮雞肉的包裝與儲藏，與對照組相比，復(fù)合膜組具有維持和改善雞肉品質(zhì)的潛力。

研究表明，多酚類物質(zhì)可與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[2]，使得蛋白材料的性能得到改善。郭叢珊等[8]在大豆分離蛋白膜中加入茶多酚，發(fā)現(xiàn)復(fù)合膜的拉伸強度和阻水性能顯著提升；張慧蕓等[9]在玉米醇溶蛋白膜中加入丁香酚類物質(zhì)，改善了蛋白膜的機械性能，增強了蛋白膜的阻隔性和透濕性。丁香酚是自然界中較為常見的一種天然多酚，具有抗菌、抗真菌、殺蟲和抗氧化等良好的生物活性，且酚類化合物和蛋白質(zhì)共價鍵的交聯(lián)作用很強，熱穩(wěn)定性能更好[2]。目前有關(guān)于酚類化合物對高粱醇溶蛋白膜的研究報道非常有限，且主要集中在理化性能，而有關(guān)膜的光學(xué)屬性、熱特性、微觀結(jié)構(gòu)等反映其變化機理的研究鮮見報道。因此，本研究以高粱醇溶蛋白為原料，甘油、聚乙二醇為增塑劑，添加具有交聯(lián)作用的丁香酚，制備丁香酚-高粱醇溶蛋白可食膜，分析不同濃度丁香酚對可食性高粱醇溶蛋白膜物理性能及微觀結(jié)構(gòu)的影響，并探討其變化機理，旨在為高粱醇溶蛋白應(yīng)用于可降解、可食性膜新材料的后續(xù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白高粱粉(食品級，粉末)，購自西安晉恒化工有限公司；丁香酚(純度> 98%，食品級)、無水乙醇(分析純)、焦亞硫酸鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)，均購自航景生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

0～10 mm千分測厚規(guī)，蘇州明哲量具有限公司；SpectraMax- i3酶標儀，美國Molecular Devices公司；TA.XT Plus-01質(zhì)構(gòu)儀，英國SMSTA公司；200-F3型差示掃描量熱儀(differential scanning calorimentry, DSC)，德國NETZSCH公司；Tensor-27型傅里葉紅外(fourier transform infrared, FTIR)光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高粱醇溶蛋白的提取 參照李曉暉等[10]的方法。取0.5 kg白高粱粉，加入2 L 70%(v/v)乙醇溶液、7 g氫氧化鈉(0.35%，w/v)和10 g焦亞硫酸鈉(0.5%，w/v)作為還原劑，在70℃水浴條件下恒溫振蕩浸提4 h。將所得混合液離心(5 000 r·min-1，10 min)，保留上清液，上清液中加入蒸餾水[<10℃，1∶1(v/v)]沉淀蛋白，用1 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5 左右，緩慢攪拌溶液直至白色絮狀沉淀逐漸析出。靜置一夜后離心(5 000 r·min-1，10 min)取沉淀，冷凍干燥蛋白沉淀(-20℃)，蛋白沉淀再經(jīng)正己烷[1∶10(w/v)]脫脂后得到高粱醇溶蛋白，儲藏于干燥器中，備用。

1.3.2 可食用膜的制作 取6.0 g高粱醇溶蛋白，加入1.48 g增塑劑(聚乙二醇∶甘油=1∶1,v/v)和60 mL 85%乙醇溶液，緩慢攪拌均勻后置于80 ± 2℃的水浴鍋中攪拌15 ± 2 min，再于40 ± 2℃的恒溫水浴鍋中冷卻，最后用85%乙醇溶液補充揮發(fā)的乙醇溶液。各試驗組中分別加入0%(對照，CK)、2%、4%、6%、8%(w/w)丁香酚，均質(zhì)(6 000 r·min-1)2 min后于40℃、100 r·min-1條件下攪拌10 min，以除去氣泡。將成膜溶液緩慢倒在玻璃板上(0.09 g·cm-2)，50 ± 2℃靜止12 h。將干燥成型的膜剝落，在進行理化試驗之前，將膜置于干燥器中48 h，以平衡水分。

1.3.3 可食用膜厚度的測定 利用千分測厚規(guī)測量膜的厚度(精確度：± 0.001 mm)。以膜中心為基準點，在距離中心點等距離的四角隨機取8個點測量膜的厚度，結(jié)果取平均值，單位μm。

1.3.4 可食用膜機械性能的測定 利用質(zhì)構(gòu)儀測量膜的拉伸應(yīng)力(tensile stress, TS)、斷裂伸長率(elongation at break, EAB)。將膜剪成60 mm×10 mm的條狀，初始夾距設(shè)為40 mm，拉伸速度設(shè)為1 mm·s-1。試驗之前將樣品提前24 h放于干燥器中平衡水分。

1.3.5 可食用膜吸光度值的測定 用打孔器取直徑為6 mm的膜樣品緊貼于微孔底部，利用酶標儀測定樣品在200～800 nm范圍內(nèi)的吸光度值，掃描波長間隔5 mm。

1.3.6 可食用膜水蒸氣透過系數(shù)測定 參照McHugh等[11]的方法。在5 mL的小燒杯中加入5 mL去離子水，用可食用膜(4 cm×4 cm)密封燒杯口，然后置于干燥器中。間隔1.5 h稱重一次，得到樣品質(zhì)量相對于時間變化的斜率。按照公式計算水蒸氣透過系數(shù)(water vapor permeability，WVP)：

(1)

式中，WVTR(water vapor transmission rate)為膜的水蒸氣透過率(g·h-1·m-2)，由質(zhì)量隨時間的變化率除以膜的封口面積(m2)得到；L是膜的平均厚度(mm)；ΔP為膜兩側(cè)水蒸氣分壓差(kPa)。

1.3.7 可食用膜的溶解性 參照Ahmad等[12]的方法。取28～32 cm2膜樣品，于105 ± 2℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，記為Wi。將樣品浸沒在40 mL去離子水中，用封口膜封住容器口，室溫下浸泡24 h后用濾紙過濾溶液，將濾紙和濾渣于105 ± 2℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，記為Wf。按照公式計算膜的水溶性(water solubility，WS)：

(2)

式中，Wi為膜初始重量，Wf為濾渣最終重量。

1.3.8 可食用膜DSC測定 參照Chen等[13]的方法。用分析天平稱取10～15 mg樣品，置于鋁制坩堝中壓片封口，放入DSC儀中。用空鋁皿作為參照，氮氣作為保護氣和吹掃氣，流量分別為60 mL·min-1、20 mL·min-1。以10℃·min-1的升溫速率從20℃加熱至140℃。

1.3.9 可食用膜FTIR光譜儀測定 參照Gu等[14]的方法。稱取0.2 mg干燥至恒重的樣品，加入2 mg溴化鉀在研缽中研磨，取適量研磨均勻樣品壓片，在波長400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)進行掃描，得到樣品在不同波長下的吸光度。

1.3.10 可食用膜二級結(jié)構(gòu)分析 對樣品紅外光譜進行傅里葉變換去卷積，用PeakFit 4.11進行二階導(dǎo)數(shù)擬合，得到子峰數(shù)目在8～12之間，其殘差(r2)大于0.999。確認峰位歸屬，計算各分峰面積的相對百分含量。

1.3.11 可食用膜掃描電鏡分析 參考鄒小波等[15]的方法。取1 cm×4 cm膜樣品，液氮浸沒后進行人工折斷，將樣品粘貼于金屬圓臺上，真空狀態(tài)下噴金，然后置于掃描電鏡中，電子束加速電壓設(shè)為10.0 kV，在放大倍數(shù)1.0 K下拍照記錄。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，用AVOVA法對數(shù)據(jù)進行方差分析，Duncan多重檢驗進行數(shù)據(jù)間的差異顯著性分析(P<0.05)。應(yīng)用Origin 9.0繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚濃度對高梁醇溶蛋白膜機械性能的影響

2.1.1 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜厚度的影響 由表1可知，高粱醇溶蛋白膜的厚度在116.56～136.11 μm范圍內(nèi)，符合美國材料與實驗協(xié)會(ASTM)的標準(≤250 μm)[16]。隨著丁香酚濃度的增加，蛋白膜的厚度呈先降低后增加的趨勢，當(dāng)丁香酚濃度為4%時，膜厚度有最小值(116.56 μm)，這是因為在一定濃度范圍內(nèi)添加丁香酚，高粱醇溶蛋白各組分間的疏水性相互作用降低，蛋白分子與多酚之間的氫鍵作用加強，從而膜內(nèi)部交聯(lián)更加緊密，膜的厚度降低。結(jié)果表明，4%濃度的丁香酚更有利于蛋白分子之間的交聯(lián)。

表1 丁香酚濃度對高梁醇溶蛋白膜厚度、機械性能的影響Table 1 Effect of eugenol concentration on the thickness and mechanical properties of kafirin film

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著 (P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatment at 0.05 level.

2.1.2 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜拉伸強度、斷裂伸長率的影響 由表1所示，對照組(CK)高粱醇溶蛋白膜的TS為111.68 N·mm-1，當(dāng)丁香酚濃度≤4%時，隨著丁香酚濃度的增加，復(fù)合蛋白膜的TS增大；當(dāng)丁香酚濃度大于4%，隨著丁香酚濃度的增加，復(fù)合蛋白膜的TS減小。添加4%丁香酚時，復(fù)合蛋白膜的TS值為127.19 N·mm-1，與CK相比，增加了13.89%，這是因為多酚中的羥基和蛋白分子中的氨基酸殘基和羧基結(jié)合形成氫鍵，故分子間的作用力增加[17]。丁香酚濃度為4%時，復(fù)合蛋白膜的EAB值為190.07%，較CK增加了70.54%。綜上，丁香酚濃度為4%時，丁香酚/高粱醇溶蛋白復(fù)合膜的機械性能有最優(yōu)值。

2.2 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜吸光度的影響

由圖1可知，在紫外波長(230～400 nm)范圍內(nèi)，CK和試驗組蛋白膜均出現(xiàn)一個吸收峰，這是因為高粱醇溶蛋白中含有帶苯環(huán)結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)，其對紫外光具有一定的吸收能力[2]。添加不同濃度的丁香酚后，吸收峰的吸光度值更高，這是因為丁香酚中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)和不飽和鍵對紫外光也具有一定的吸收能力。在可見光波長范圍(400～800 nm)內(nèi)，隨著波長的增加，蛋白膜的吸光度值逐漸降低，添加不同濃度的丁香酚后，蛋白膜的吸光度值均有不同程度的增加。

注：a、b、c、d、e分別表示0%(CK)、2%、4%、6%、8%丁香酚。Note: a, b, c, d and e indicate 0%(control), 2%, 4%, 6% and 8% eugenol, respectively.圖1 丁香酚濃度對高梁醇溶蛋白膜吸光度的影響Fig.1 Effect of eugenol concentration on absorbance of kafirin film

2.3 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜水溶性和水蒸氣透過系數(shù)(WVP)的影響

由圖2可知，隨著丁香酚濃度的增大，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的水溶性顯著增加(P<0.05)，當(dāng)丁香酚濃度為4%時，相比CK，膜的水溶性增加了7.1%，增幅最小，更適合作為高粱醇溶蛋白膜的改性劑。添加不同濃度的丁香酚后，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的水蒸氣透過系數(shù)(WVP)無顯著變化，這是因為膜的WVP不僅與膜的性能相關(guān)，也受到醇溶蛋白分子中極性基團的共價鍵、丁香酚分子內(nèi)部羥基及膜中水分子擴散路徑的影響[18]。

注：不同小寫字母表示相同指標不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments of the same index.圖2 丁香酚濃度對醇溶蛋白膜水溶性、水蒸氣透過系數(shù)的影響Fig.2 Effect of eugenol concentration on water solubility and WVP of kafirin film

2.4 差式掃描量熱儀分析結(jié)果

由圖3可知，CK醇溶蛋白膜的Tg值為76.97℃，隨著丁香酚濃度的增加，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度(glass-transition temperture，Tg)值呈先下降后上升的變化趨勢。其中，Tg值下降是因為加入丁香酚，多酚中的羥基與蛋白分子結(jié)合形成氫鍵，混合體系的疏水性降低、親水性增加。當(dāng)丁香酚濃度為4%時，高粱醇溶蛋白復(fù)合膜的Tg值有最小值，為60.16℃。

圖3 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜DSC熱譜圖Fig.3 DSC thermograms of kafirin films incorporated with eugenol

2.5 傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

由圖4可知，CK高粱醇溶蛋白膜的酰胺A峰(O-H伸縮振動峰[10])在3 407 cm-1處，隨著丁香酚濃度的逐漸增大，復(fù)合膜的酰胺A峰先紅移再藍移，分別為3 398、3 383、3 395、3 397 cm-1。添加不同濃度丁香酚，酰胺B峰(-CH3和-CH的反對稱伸縮振動峰[19])由2 944.8 cm-1小幅度紅移至 2 943.8、2 942.8、2 943.8、2 944.8 cm-1。Herrero等[20]研究發(fā)現(xiàn)-CH峰的位移受氨基酸殘基的疏水性影響，由此表明，添加丁香酚影響了高粱醇溶蛋白氨基酸殘基的疏水性，該結(jié)果印證了復(fù)合膜的水溶性增加及Tg值降低的變化趨勢。

圖4 丁香酚高粱醇溶蛋白膜傅里葉紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of kafirin edible films incorporated with eugenol

2.6 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

1 600～1 640 cm-1、1 640～1 650 cm-1、1 650～1 660 cm-1及1 660～1 700 cm-1之間的峰面積分別表征β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量[19]。由圖5可知，隨著丁香酚濃度的增加，復(fù)合膜的β-轉(zhuǎn)角含量增加，當(dāng)丁香酚濃度為4%時，β-轉(zhuǎn)角含量出現(xiàn)最大值；α-螺旋、無規(guī)則卷曲含量隨著丁香酚濃度的增加而降低，當(dāng)丁香酚濃度為4%時，兩者有最小值。這是因為添加丁香酚改變了復(fù)合膜內(nèi)部蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成β結(jié)構(gòu)[10]。

圖5 丁香酚高粱醇溶蛋白膜二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Content of secondary of kafirin films containing eugenol

2.7 掃描電鏡分析結(jié)果

由圖6可知，CK膜的表面和截面粗糙，有較多蛋白顆粒和小孔，蛋白溶解性不好；添加2%丁香酚，膜截面平滑度增加，蛋白顆粒減少了，小孔數(shù)量降低了，表明丁香酚與蛋白相容性較好；添加4%丁香酚，膜的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膜表面小孔數(shù)量明顯降低，截面光滑緊致，表明醇溶蛋白與丁香酚分子間結(jié)合良好，膜內(nèi)部分子排列有序；繼續(xù)增加丁香酚濃度，膜截面變得疏松，小孔增多。該結(jié)果與機械性能和二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果相對應(yīng)，蛋白膜內(nèi)部小孔數(shù)量越少，膜表面越平滑，二級結(jié)構(gòu)中的β結(jié)構(gòu)含量越多，機械性能相對越好[21]。

3 討論

本試驗結(jié)果表明，當(dāng)丁香酚濃度為4%時，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的厚度、水溶性均有最優(yōu)值，同時，顯著提升了膜的TS、EAB，增加了膜對紫外光和可見光的阻隔性，且基本不影響復(fù)合膜的WVP。添加一定濃度的丁香酚后，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的TS、EAB增大，表明隨著丁香酚濃度的增加，高粱醇溶蛋白分子間的疏水性相互作用減弱，多酚類物質(zhì)中的羥基與醇溶蛋白分子中的氨基酸殘基和羧基結(jié)合形成氫鍵占據(jù)主導(dǎo)，故膜基質(zhì)內(nèi)部交聯(lián)更加緊密，膜的強度增加。但當(dāng)丁香酚濃度超過4%后，蛋白分子周圍聚集大量酚類物質(zhì)的羥基，打斷了原有醇溶蛋白分子間的有序排列，多肽鏈間的流動性增大，因此膜內(nèi)部分子之間的交聯(lián)減弱，拉伸應(yīng)力降低，延展性持續(xù)增加。丁香酚濃度為4%時，膜的EAB值為190.07%，優(yōu)于Giteru等[7]制備的檸檬醛、槲皮素高粱醇溶蛋白膜的EAB(147.0%)。高粱醇溶蛋白是一種疏水性蛋白質(zhì)，用其制成的蛋白膜結(jié)構(gòu)致密，對環(huán)境中的水蒸氣有很好的阻隔性能，較已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的大豆分離蛋白膜、魚鱗明膠膜，高粱醇溶蛋白膜的阻水性能更好。Otoni等[22]在大豆分離蛋白中加入丁香酚，復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)為1.06 ×10-10g·s-1·m-1·pa-1，是本試驗中高粱醇溶蛋白膜水蒸氣透過系數(shù)的13.6倍；Nazmi等[23]用雞皮明膠制作明膠膜，其水蒸氣透過系數(shù)高達1.36×10-4g·s-1·m-1·pa-1，為本試驗中高粱醇溶蛋白膜的106倍。膜的吸光度值越高，透光率值越低，光阻隔性能越好。當(dāng)丁香酚濃度為4%時，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜對紫外、可見光的阻隔性能均出現(xiàn)最優(yōu)值。綜上表明，添加4%丁香酚的高粱醇溶蛋白復(fù)合膜的性能最優(yōu)。

蛋白分子間的疏水性相互作用使得蛋白分子聚集在一起[24]，從而保證膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性。在高梁醇溶蛋白中加入丁香酚，隨著多酚濃度的增加(2%、4%)，醇溶蛋白分子中的氨基與羰基同多酚物質(zhì)中的羥基形成氫鍵，增加了蛋白多肽鏈間的連接，因此FTIR圖中的O-H峰低波數(shù)位移，宏觀表現(xiàn)為丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的機械性能增大、水溶性增加。Iman等[25]指出，蛋白分子間作用力增強時，會伴隨著吸收峰的紅移，本試驗中分子間相互作用呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，這與復(fù)合膜的拉伸強度變化相一致。本研究中，添加丁香酚后，復(fù)合膜的Tg值呈現(xiàn)先降低后增加的變化趨勢。Ghanbarzadeh等[26]研究發(fā)現(xiàn)，親水性強的乳清蛋白膜的Tg值低于玉米醇溶蛋白膜的Tg值，基于此研究，Huo等[27]指出，Tg值和材料的疏水性能成正比。因此，本試驗中添加丁香酚后醇溶蛋白膜的Tg值降低印證了添加丁香酚后復(fù)合膜水溶性略微變大的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，各試驗組膜的表面和截面均含有不同數(shù)量的小孔，這是因為高粱醇溶蛋白中含有較多的疏水性氨基酸，在成膜過程中添加的親水能力較強的甘油、聚乙二醇很難與高粱醇溶蛋白中的疏水集團結(jié)合[28]，使得部分甘油和聚乙二醇從膜內(nèi)部遷移到膜的表面，從而在膜的內(nèi)部形成孔徑，表現(xiàn)為膜截面的小孔。在一定濃度范圍內(nèi)添加小分子物質(zhì)丁香酚，復(fù)合膜中的氫鍵能較好地降低混合體系內(nèi)部的吉布斯自由能，使各組分很好的相容[22]，因此，膜表面小孔數(shù)量降低。添加4%丁香酚與高粱醇溶蛋白相容性良好，膜截面光滑緊致，表面平整。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，添加4%(w/w)丁香酚后，丁香酚/高粱醇溶蛋白可食性復(fù)合膜的水溶性略微增加，但復(fù)合膜的拉伸應(yīng)力(TS)和斷裂伸長率(EAB)提升，且對紫外光和可見光的阻隔性增加，表明添加丁香酚有利于開發(fā)機械性能高、阻隔性能好、熱穩(wěn)定性能優(yōu)良的高粱醇溶蛋白膜材料，這解決了高粱醇溶蛋白膜材料黏性、延伸性及抗拉強度差的問題，其機械性能可滿足實際生產(chǎn)需要?，F(xiàn)有技術(shù)的研究主要是試驗室規(guī)模的操作和在食品中的應(yīng)用，接下來需進一步優(yōu)化蛋白質(zhì)膜制備技術(shù)，提高可食性膜的物化性質(zhì)。