酸性硫酸鈣處理對(duì)水蜜桃采后匍枝根霉致病力的影響

劉晨霞 喬勇進(jìn) 黃宇斐 王 曉

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403；2 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境學(xué)院，上海 200234)

采后腐爛是限制果蔬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，發(fā)達(dá)國(guó)家新鮮果蔬采后腐爛率為5%～6%，發(fā)展中國(guó)家高達(dá)20%～30%。影響新鮮果蔬采后貯藏品質(zhì)劣變的因素諸多，其中真菌性病害是導(dǎo)致果實(shí)采后貯藏品質(zhì)劣變的最重要的因素之一[1-2]。匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)是一種強(qiáng)寄生病原菌，是導(dǎo)致桃采后腐爛的主要致病菌，其生長(zhǎng)繁殖和傳染速率很快，孢子借氣流即可傳播，一旦侵入寄主就會(huì)迅速蔓延，且低溫不會(huì)影響匍枝根霉的生長(zhǎng)。匍枝根霉不僅能造成大量桃果腐爛變質(zhì)，還能引起杏[3]、梨[4]、葡萄[5]、甜瓜[6]、獼猴桃[7]、金針菇[8]、甘薯[9]等果蔬采后腐爛。國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者對(duì)匍枝根霉病原菌的防治手段進(jìn)行了大量研究，陳秋平等[10]研究發(fā)現(xiàn)脈沖強(qiáng)光能通過(guò)改變匍枝根霉的細(xì)胞膜通透性和胞內(nèi)酶活性來(lái)抑制菌體生長(zhǎng)；周小虹[11]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌株A82-2可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和空間競(jìng)爭(zhēng)抑制水蜜桃匍枝根霉生長(zhǎng)；袁勇軍等[12]發(fā)現(xiàn)BacillussubtilisY-6所產(chǎn)抗菌肽能夠破壞匍枝根霉孢子壁，抑制其呼吸代謝和生物合成相關(guān)酶活性；李紅葉等[13]研究結(jié)果顯示脫乙酰殼多糖能夠破壞匍枝根霉細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制菌體生長(zhǎng)。但這些物理和生物防治技術(shù)操作不便、成本較高、不宜規(guī)?；褂?，而撲海因、仲丁胺和二氧化硫等化學(xué)殺菌劑雖能殺死匍枝根霉等病原微生物，但均存在不同程度的殘留，會(huì)威脅人體健康，造成環(huán)境污染[14]。因此，急需研制出一種操作簡(jiǎn)便、適宜推廣且安全性高的抑制或殺滅匍枝根霉的方法。

酸性硫酸鈣(acidic calcium sulfate，ACS)是目前國(guó)際上最新型的符合“GRAS”安全標(biāo)準(zhǔn)的一種高效殺菌防腐保鮮產(chǎn)品，且已獲得美國(guó)FDA和USDA認(rèn)證，具有酸性強(qiáng)、易溶于水、低腐蝕、緩腐蝕的特點(diǎn)[15-16]。ACS溶液中含有H3O+、H5O2+和H7O3+等高濃度的水合氫離子，研究表明，其原液稀釋100～800倍后對(duì)細(xì)菌繁殖體(大腸桿菌、李斯特菌、沙門(mén)氏菌)和病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒)的殺菌效果良好[17-20]。ACS的殺菌機(jī)理一般認(rèn)為是較低pH值給細(xì)菌、真菌、芽孢和病毒等微生物提供不適宜的生存環(huán)境，使維持胞內(nèi)外pH值動(dòng)態(tài)平衡的氫離子泵被破壞，呼吸系統(tǒng)和能量供給系統(tǒng)紊亂，代謝失調(diào)，引起菌體休眠或者死亡，這與ClO2抑制或殺死匍枝根霉的機(jī)理[5]相似，但其具體作用機(jī)理并不單一，尚需進(jìn)一步研究[19,21]。匍枝根霉是一種危害廣泛的植物病原菌，分泌果膠酶和纖維素酶的能力強(qiáng)，破壞力極大，損傷桃果細(xì)胞壁，進(jìn)而更加有利病原菌的侵入、定殖與擴(kuò)散，使得桃果大量腐爛。因此，本研究通過(guò)分析不同稀釋倍數(shù)的ACS溶液對(duì)匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶和呼吸酶活性的影響，以期能有效抑制因匍枝根霉侵染引起的水蜜桃采后軟腐病。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水蜜桃匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)，從自然發(fā)病的水蜜桃病果上分離純化獲得，并經(jīng)活體回接，驗(yàn)證其為水蜜桃軟腐病致病菌——匍枝根霉，再次分離純化后于4℃條件下低溫保存，備用。水蜜桃，品種為湖景蜜露，種植于上海市桃研究所標(biāo)準(zhǔn)園，采摘后立刻運(yùn)回上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心冷庫(kù)。挑選果實(shí)飽滿(mǎn)、大小均一、無(wú)機(jī)械傷和病蟲(chóng)害的水蜜桃果實(shí)，在2～4℃條件下預(yù)冷24 h后，進(jìn)行損傷接種試驗(yàn)處理。

ACS原液，購(gòu)自美國(guó)Mionix公司；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、半乳糖醛酸、果膠、水楊苷、95%酒精等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MDH)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CA-1480超凈工作臺(tái)，上海凈化設(shè)備有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋，日本托米公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊有限公司；JX-FSTPR-1全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀，上海凈信科技公司；FE30臺(tái)式電導(dǎo)率儀，梅特勒-托利多儀器有限公司；Testo 230 pH計(jì)，德國(guó)Testo公司；Ultro-spec 3300 pro紫外分光光度計(jì)，美國(guó)安馬西亞公司。

1.3 供試培養(yǎng)基的配置

RBM培養(yǎng)基：取孟加拉紅培養(yǎng)基36.6 g用蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌后備用。

PD培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g加入蒸餾水煮沸15 min，然后加入葡萄糖20 g并定容至1 000 mL，滅菌后備用。

細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉鹽10 g、磷酸二氫鉀1.0 g、七水合硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、硝酸鉀2.0 g、L-天冬酰胺0.5 g、維生素B10.2 mg，用去離子水溶解后定容至1 000 mL，pH值調(diào)至6.0，滅菌后備用。

1.4 ACS稀釋液的配置及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

1.4.1 ACS稀釋液的配置 用蒸餾水將ACS原液分別稀釋103、104、105和106倍，配置成不同稀釋倍數(shù)的ACS溶液，并記錄稀釋液pH值[ACS-10-3(pH 值1.89±0.06)、ACS-10-4(pH 值2.95±0.10)、ACS-10-5(pH 值4.07±0.08)和ACS-10-6(pH 值5.64±0.20)]，每個(gè)ACS稀釋液配制重復(fù)3次，備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作參照曹建康等[22]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸法。取7支具塞試管，編號(hào)，分別精確加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液后用蒸餾水滴加至2 mL，再加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻后在沸水浴中加熱5 min，取出冷卻至室溫后用蒸餾水定容至25 mL，混勻，用0號(hào)試管作參比調(diào)零，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下顯色液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程。

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作同樣參照曹建康等[22]的方法，采用咔唑比色法。取6支具塞試管，編號(hào)，分別精確加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 μg·mL-1半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液后用蒸餾水滴加至2 mL，再加入6 mL濃硫酸，混勻后在沸水浴中加熱5 min，取出冷卻至室溫后，各加入0.2 mL 1.5 g·L-1咔唑-乙醇溶液，混勻，暗處放置30 min，用0號(hào)試管作參比調(diào)零，測(cè)定530 nm波長(zhǎng)下反應(yīng)液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，半乳糖醛酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 匍枝根霉相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 菌絲體收集：將在純RBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d(溫度28℃)的匍枝根霉用0.4 cm的打孔器打孔，菌餅接種到已滅菌的含有50%ACS稀釋液的PD培養(yǎng)基中，每瓶接種5個(gè)菌餅，在28℃條件下恒溫?fù)u床(130 r·min-1)培養(yǎng)2 d；無(wú)菌條件下將剝離菌餅的菌絲接種到新配置的不同稀釋倍數(shù)的ACS帶藥培養(yǎng)基中，然后28℃條件下恒溫?fù)u床(130 r·min-1)繼續(xù)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)結(jié)束后取出菌絲團(tuán)并用無(wú)菌蒸餾水沖洗，再經(jīng)布氏漏斗抽濾后收集菌絲體，保存?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確稱(chēng)量1.0 g菌絲體，加入含有100 mL ACS稀釋液的錐形瓶中，用電導(dǎo)儀測(cè)定此時(shí)溶液的電導(dǎo)率(C0)，然后將其置于28℃恒溫?fù)u床(130 r·min-1)震蕩培養(yǎng)，分別測(cè)定培養(yǎng)0、20、40、60、80、100、120 min時(shí)溶液(軟腐病菌菌絲體浸出液)的電導(dǎo)率(C1)。測(cè)定完成后將錐形瓶放入沸水中煮沸15 min，以殺死菌絲體，待冷卻至室溫后測(cè)定此時(shí)各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)下溶液的電導(dǎo)率值(C殺)。每試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理組設(shè)10個(gè)平行。根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率：

(1)。

1.5.2 匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶活性的測(cè)定

1.5.2.1 細(xì)胞壁降解酶粗酶液的制備 將不同的稀釋倍數(shù)的ACS溶液與細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置成體積分?jǐn)?shù)為50%的ACS帶藥培養(yǎng)基，121℃高溫滅菌20 min后冷卻備用。在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d的純RBM培養(yǎng)基上各取5塊直徑為5 mm的匍枝根霉菌餅，分別接種于體積分?jǐn)?shù)為50%的不同稀釋倍數(shù)的ACS帶藥培養(yǎng)基中，以體積分?jǐn)?shù)為50%的無(wú)菌水和細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基的混合液為對(duì)照組(CK)，在28℃恒溫?fù)u床(120 r·min-1)中培養(yǎng)，每隔24 h時(shí)取樣1次，共培養(yǎng)9 d。取樣后12 000 r·min-1離心15 min，所得上清液即為匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶的粗酶液。

1.5.2.2 匍枝根霉中多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活力的測(cè)定 取1.9 mL 0.5%果膠于25 mL試管中，50℃條件下預(yù)熱10 min，然后加入0.1 mL匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶的粗酶液，50℃條件下反應(yīng)30 min，再加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫后蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定其540 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。以每小時(shí)每毫升酶液分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

1.5.2.3 匍枝根霉中聚甲基半乳糖醛酸酶(polymethylgalacturonase，PMG)活力測(cè)定 取1.5 mL 1%果膠于25 mL試管中，30℃條件下水浴30 min，然后加入0.5 mL匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶的粗酶液，30℃條件下反應(yīng)30 min，再加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫后蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定其540 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。以每小時(shí)每毫升酶液分解果膠產(chǎn)生1 mg還原糖為一個(gè)酶活力單位。

1.5.2.4 匍枝根霉中甲基纖維素酶(cellulase，CX)活力的測(cè)定 取1.5 mL 0.51% 羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)溶液于25 mL試管中，50℃預(yù)熱10 min后加入0.5 mL匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶的粗酶液，50℃條件下反應(yīng)30 min，再加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫后蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定其540 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。以每小時(shí)每毫升酶液分解CMC產(chǎn)生1 mg還原糖為一個(gè)酶活力單位。

1.5.2.5 匍枝根霉中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，GLU)活力的測(cè)定 取1.5 mL 10 g·L-1的水楊苷溶液于25 mL試管中，37℃預(yù)熱10 min后加入0.5 mL匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶的粗酶液，37℃條件下反應(yīng)30 min，再加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫后蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定其540 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。以每小時(shí)每毫升酶液分解底物產(chǎn)生1 mg還原糖為一個(gè)酶活力單位。

1.5.3 匍枝根霉中呼吸相關(guān)酶的測(cè)定 呼吸相關(guān)酶粗酶液的制備：按1.5.2中細(xì)胞壁降解酶粗酶液的制備方法制作呼吸相關(guān)酶粗酶液，只需將細(xì)胞壁降解酶培養(yǎng)基改為PD培養(yǎng)基即可，其他步驟相同。

匍枝根霉呼吸相關(guān)酶粗酶液中琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MDH)和異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行樣品處理、藥品劑量添加和酶活力測(cè)定。

1.5.4 匍枝根霉致病力的測(cè)定

1.5.4.1 匍枝根霉孢子懸浮液的制備 將活化培養(yǎng)5 d的匍枝根霉用無(wú)菌水沖洗稀釋成1×105個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)，備用。

1.5.4.2 桃果實(shí)預(yù)處理 將預(yù)冷處理的湖景蜜露水蜜桃平均分為5組，每個(gè)處理組50個(gè)桃果，分別按照以下5種方式進(jìn)行浸泡處理：對(duì)照組(CK，pH值7)；ACS-10-3組，10-3倍ACS稀釋液(pH值1.89)；ACS-10-4組，10-4倍ACS稀釋液(pH值2.95)；ACS-10-5組，10-5倍ACS稀釋液(pH值4.07)；ACS-10-6組，10-6倍ACS稀釋液(pH值5.64)。將浸泡處理過(guò)的水蜜桃在無(wú)菌操作臺(tái)吹干果皮表面水分后，用消毒滅菌的打孔器在水蜜桃果實(shí)無(wú)縫合線(xiàn)的赤道部位打取直徑為5 mm、深約2 mm的傷口，并晾干至傷口處無(wú)汁液。

1.5.4.3 桃果實(shí)接種軟腐病菌孢子 吸取10 μL匍枝根霉孢子懸浮液并于無(wú)菌條件下接種于桃果實(shí)傷口處，接種后的水蜜桃果實(shí)用厚度為0.02 mm的聚乙烯打孔薄膜進(jìn)行包裝，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(十字交叉法)。每隔24 h測(cè)定各處理組桃果實(shí)的病斑直徑，按照公式計(jì)算桃果實(shí)病斑面積和發(fā)病率：

(2)

(3)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析，應(yīng)用Origin Pro 8.0軟件制圖。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)SPSS Statistics 17.0采用Duncan法確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACS處理對(duì)匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率的影響

真菌細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境間的機(jī)械屏障和滲透屏障，能夠調(diào)控細(xì)胞間相互關(guān)系及表面吸附、合成和分泌等作用；當(dāng)組織細(xì)胞膜受到破損，細(xì)胞膜透性增大，膜內(nèi)電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致細(xì)胞浸提液電導(dǎo)率增大，因此，細(xì)胞膜滲透率是表征細(xì)胞膜破損程度的重要指標(biāo)[23-24]，即菌絲的細(xì)胞膜滲透率能以相對(duì)電導(dǎo)率表示。由圖1可知，不同稀釋倍數(shù)的ACS溶液對(duì)匍枝根霉細(xì)胞膜有不同程度的破壞作用，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ACS稀釋倍數(shù)愈低，對(duì)匍枝根霉細(xì)胞膜的損傷愈大。隨著處理時(shí)間的增加，CK和各處理組的匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率(相對(duì)電導(dǎo)率)均逐漸增加。當(dāng)處理時(shí)間為120 min時(shí)，ACS-10-3組、ACS-10-4組和ACS-10-5組的匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率分別較CK高出39.72%、23.64%和12.88%，且統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表明，除ACS-10-6組外，其他處理組的匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率與CK之間差異顯著(P<0.05)。綜上表明，稀釋倍數(shù)較低的ACS溶液能夠較大程度地破壞匍枝根霉的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜滲透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物滲出，以此抑制匍枝根霉的生長(zhǎng)繁殖能力，減少其對(duì)水蜜桃果實(shí)的侵害。

圖1 ACS對(duì)匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率的影響Fig.1 Effect of acid calcium sulfate on cell membrane permeate rate of Rhizopus stolonifer

2.2 ACS處理對(duì)匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶活性的影響

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、果膠質(zhì)和木聚糖等多糖類(lèi)物質(zhì)構(gòu)成，對(duì)細(xì)胞起著骨架支持和保護(hù)作用，在病原真菌侵入的過(guò)程中起主要的屏障作用[25]。因此，匍枝根霉侵染水蜜桃必須突破桃果實(shí)表面的細(xì)胞壁和角質(zhì)層屏障，在侵入桃果實(shí)的過(guò)程中，會(huì)在侵染的細(xì)胞壁部位分泌多種細(xì)胞壁降解酶，軟化及分解桃果實(shí)細(xì)胞壁，以有利病原菌的侵入、定殖與擴(kuò)散，故可通過(guò)抑制匍枝根霉細(xì)胞壁降解酶活性，減少病原菌侵染，降低桃果實(shí)腐爛率。

2.2.1 ACS處理對(duì)匍枝根霉果膠酶活性的影響 多聚半乳糖醛酸酶(PG)是果膠分解的關(guān)鍵酶之一，能夠消解組織中膠層，使桃果實(shí)細(xì)胞壁的胞間層結(jié)構(gòu)變得疏松，使果實(shí)軟化，硬度下降[26]。由圖2可知，在培養(yǎng)過(guò)程中，CK和各處理組的PG活性均呈先迅速升高后緩慢上升再下降的變化趨勢(shì)。培養(yǎng)第3天時(shí)，CK和各處理組匍枝根霉的PG活性達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，培養(yǎng)第9天時(shí)，ACS-10-3組、ACS-10-4組、ACS-10-5組和ACS-10-6組匍枝根霉的PG活性分別為CK的61.59%、79.56%、91.43%和96.56%，且均顯著低于CK(P<0.05)。說(shuō)明ACS稀釋液能夠有效抑制匍枝根霉的PG活性，使匍枝根霉侵染和分解桃果實(shí)細(xì)胞壁的速率降低。

聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)屬于果膠酶系的一種能夠催化果膠分子多聚α-1,4-聚甲半乳糖醛酸的裂解酶，在匍枝根霉的致病過(guò)程中起著分解寄主表皮細(xì)胞中果膠的作用[27]。由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，匍枝根霉PMG活性整體呈先增加后降低的變化趨勢(shì)。其中，ACS-10-3組匍枝根霉PMG活性在培養(yǎng)至第5天達(dá)到峰值(17.11 μg·h-1·g-1)，其他處理組峰值延遲了2 d，且ACS-10-3組匍枝根霉的PMG活性顯著低于CK和其他處理組(P<0.05)；培養(yǎng)至第9天時(shí)，由于匍枝根霉菌體數(shù)量較大，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)消耗嚴(yán)重，致使其PMG活性開(kāi)始下降，各處理組的匍枝根霉PMG活性顯著低于CK(P<0.05)，說(shuō)明ACS能夠有效抑制匍枝根霉PMG活性，降弱對(duì)桃果皮細(xì)胞的降解作用，其中ACS-10-3處理組對(duì)匍枝根霉PMG活性的抑制效果最強(qiáng)。

圖3 ACS對(duì)匍枝根霉聚甲基半乳糖醛酸酶活性的影響Fig.3 Effect of acid calcium sulfate on PMG activity of Rhizopus stolonifer

2.2.2 ACS處理對(duì)匍枝根霉纖維素酶活性的影響 甲基纖維素酶(CX)能夠降解纖維素，是植物病原菌所分泌的重要致病因子，在植物的致病過(guò)程中分解植物表皮細(xì)胞的纖維素，引起細(xì)胞壁損傷及組織浸解[28]。由圖4可知，不同稀釋倍數(shù)的ACS溶液對(duì)水蜜桃匍枝根霉CX活性的抑制效果不同，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，匍枝根霉CX活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。培養(yǎng)初期，CK和各處理組的匍枝根霉CX活性增加速率較快，培養(yǎng)第5 天時(shí)，CK、ACS-10-3組、ACS-10-4組、ACS-10-5組及ACS-10-6組的CX活性分別為5.97±0.28、3.34±0.34、3.85±0.13、4.54±0.28、4.97±0.35 μg·h-1·g-1，且與CK間差異顯著(P<0.05)；培養(yǎng)第9天時(shí)，各ACS稀釋液處理組的CX活性與CK(4.08 μg·h-1·g-1)相比，分別降低了59.31%、41.67%、33.82%、28.19%，且ACS-10-5組和ACS-10-6組之間差異不顯著(P>0.05)。綜上表明，ACS稀釋液能夠在一定程度上抑制水蜜桃匍枝根霉CX活性，減緩匍枝根霉降解桃果實(shí)細(xì)胞壁纖維素的速率，其中ACS-10-3組的處理效果最好。

圖4 ACS對(duì)匍枝根霉甲基纖維素酶活性的影響Fig.4 Effect of acid calcium sulfate on CXactivity of Rhizopus stolonifer

β-葡萄糖苷酶(GLU)是纖維素酶的重要組分，其活性高低對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的疏松和緊密程度有極大影響。由圖5可知，ACS-10-3組、ACS-10-4組的匍枝根霉GLU活性呈直線(xiàn)上升，而其他處理組的匍枝根霉GLU活性呈先增加后減少的變化趨勢(shì)。培養(yǎng)第7天時(shí)，CK、ACS-10-5組、ACS-10-6組的匍枝根霉GLU活性分別為4.60±0.15、3.81±0.29、4.09±0.19 μg·h-1·g-1，兩兩間差異不顯著；與第7天時(shí)相比，第9天時(shí)ACS-10-3組和ACS-10-4組的GLU活性均有所增加，分別達(dá)到2.85、3.33 μg·h-1·g-1，而CK、ACS-10-5組和ACS-10-6處理組的酶活性分別降低了3.91%、16.54%、8.31%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，各ACS稀釋液處理組的GLU活性顯著低于CK(P<0.05)。綜上表明，較低稀釋倍數(shù)的ACS溶液能顯著降低匍枝根霉GLU活性，抑制其對(duì)桃果實(shí)細(xì)胞壁的降解，這對(duì)保持桃果實(shí)完整緊致的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有重大作用。

2.3 ACS處理對(duì)匍枝根霉呼吸相關(guān)酶活性的影響

匍枝根霉通過(guò)呼吸作用維持正常的生命活動(dòng)和能量代謝，呼吸代謝酶活性的高低和變化可直接反映細(xì)胞能量代謝的狀況。琥珀酸脫氫酶(SDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)均是三羧酸循環(huán)和細(xì)胞能量代謝中的重要酶類(lèi)，對(duì)生物體的能量代謝和生物合成有較大影響，因此，可通過(guò)測(cè)定呼吸相關(guān)酶活性來(lái)反映ACS對(duì)匍枝根霉的抑制效果。

圖5 ACS對(duì)匍枝根霉β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effect of acid calcium sulfate on GLUactivity of Rhizopus stolonifer

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatment at 0.05 level.圖6 ACS對(duì)匍枝根霉呼吸相關(guān)酶活性的影響Fig.6 Effect of acid calcium sulfate on respiratory-related enzymes activity of Rhizopus stolonifer

由圖6可知，與CK相比，各處理組匍枝根霉的呼吸相關(guān)酶活性均處于較低水平，其中ACS-10-3組的SDH、MDH和IDH活性均最低，分別僅為CK的6.90%、3.60%和17.31%，說(shuō)明10-3倍的ACS溶液對(duì)匍枝根霉呼吸相關(guān)酶活性的抑制作用最強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，各處理組中匍枝根霉SDH、MDH和IDH活性均顯著低于CK(P<0.05)，但ACS-10-3組和ACS-10-4組之間的SDH、MDH活性差異不顯著，ACS-10-4組和ACS-10-5組間IDH活性無(wú)顯著差異。表明ACS溶液能夠較好地抑制匍枝根霉呼吸相關(guān)酶活性，使病原菌的三羧酸循環(huán)無(wú)法正常進(jìn)行，破壞其呼吸系統(tǒng)和能量代謝系統(tǒng)，達(dá)到抑制或殺死匍枝根霉的作用，且稀釋倍數(shù)越低的ACS溶液對(duì)匍枝根霉SDH、MDH和IDH活性的抑制效果越好。

2.4 ACS處理對(duì)水蜜桃果實(shí)致病性的測(cè)定

注：不同小寫(xiě)字母表示相同培養(yǎng)時(shí)間下不同處理組在0.05水平差異顯著(n=3)。Note：Different lowercase letters indicate significant difference among different treatment groups under the same inoculation time at 0.05 level (n=3).圖7 ACS處理對(duì)接種匍枝根霉的桃果實(shí)病斑面積和發(fā)病率的影響Fig.7 Effect of acid calcium sulfate treatment on lesion area and the incidence after inoculation with Rhizopus stolonifer of honey peach

水蜜桃果實(shí)病斑面積和發(fā)病率可作為判斷匍枝根霉分生孢子致病力強(qiáng)弱的主要指標(biāo)。由圖7-A可知，在接種初期，除CK外，各處理組的水蜜桃病斑并未出現(xiàn)擴(kuò)展；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組桃果實(shí)開(kāi)始發(fā)病且病斑面積逐漸擴(kuò)大，培養(yǎng)第3天時(shí)，CK桃果實(shí)病斑面積占整個(gè)桃果面積的50%以上(19.23±1.80 cm2)，ACS-10-5組和ACS-10-6組桃果實(shí)病斑面積分別為1.12±1.89、4.63±2.62 cm2，而ACS-10-3組和ACS-10-4組仍未發(fā)病；培養(yǎng)第5天時(shí)，CK桃果實(shí)完全腐爛，各處理組桃果實(shí)腐爛面積分別較CK降低了99.61%、96.23%、82.39%和55.49%，說(shuō)明ACS稀釋液能夠有效延緩水蜜桃果實(shí)的發(fā)病時(shí)間，降低匍枝根霉孢子萌發(fā)率和致病力。

由圖7-B可知，水蜜桃果實(shí)發(fā)病率與ACS溶液的稀釋倍數(shù)呈正相關(guān)，稀釋倍數(shù)越高，發(fā)病率越高，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，桃果實(shí)發(fā)病率不斷提高。培養(yǎng)第1天時(shí)，CK和ACS-10-6組桃果實(shí)發(fā)病率分別為46.67%和6.67%，其他處理組未發(fā)??； ACS-10-4組和ACS-10-5組在培養(yǎng)第3天開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病率分別為33.33%和50.00%，ACS-10-3組在培養(yǎng)第4天開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病率僅為10%；培養(yǎng)第5天時(shí)，與CK相比，ACS-10-3組、ACS-10-4組、ACS-10-5組、ACS-10-6組的桃果實(shí)發(fā)病率分別降低了73.33%、60.00%、26.67%和16.67%，且顯著低于CK(P<0.05)。說(shuō)明ACS稀釋液不僅能夠顯著降低匍枝根霉對(duì)水蜜桃的致病力，而且能延緩發(fā)病時(shí)間，降低桃果實(shí)發(fā)病率和病斑擴(kuò)展面積，其中ACS-10-3組水蜜桃果實(shí)病斑面積最小，發(fā)病率最低，對(duì)匍枝根霉的致病力的抑制作用最強(qiáng)。

3 討論

本研究主要探討了不同稀釋倍數(shù)的ACS溶液對(duì)匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率、相關(guān)致病酶活力及其致病力的影響，發(fā)現(xiàn)ACS溶液處理可以顯著抑制匍枝根霉的生長(zhǎng)，降低果實(shí)的腐爛率，這與Stevens等[29]和Sarig等[30]發(fā)現(xiàn)的不同殺菌措施(UV-C和臭氧熏蒸處理)對(duì)匍枝根霉抑制作用的研究結(jié)果一致。匍枝根霉經(jīng)某些方式處理后，其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的生理代謝可能受阻或異常，如Nickerson等[31]發(fā)現(xiàn)4 μg·mL-1淺藍(lán)菌素能夠使匍枝根霉線(xiàn)粒體生物合成受阻，抑制孢囊孢子萌發(fā)和芽管的形成；張瑤[32]采用茶葉提取物處理匍枝根霉，菌體細(xì)胞壁物質(zhì)被降解，細(xì)胞壁受損而無(wú)法正常生長(zhǎng)。本試驗(yàn)通過(guò)不同的ACS稀釋液對(duì)匍枝根霉進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)降低會(huì)顯著提高其對(duì)匍枝根霉細(xì)胞膜的損壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞膜滲透率增加，抑制匍枝根霉的生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)處理時(shí)間為120 min時(shí)，ACS-10-3組的匍枝根霉細(xì)胞膜滲透率達(dá)到52.76%，且顯著高于CK和其他處理組(P<0.05)。

SDH、MDH和IDH是三羧酸循環(huán)和細(xì)胞能量代謝中的重要酶類(lèi)，其活性變化可反映細(xì)胞能量代謝狀況。本研究中，ACS稀釋液通過(guò)降低SDH、MDH和IDH能量代謝酶活性，從而擾亂匍枝根霉正常生長(zhǎng)，減少桃果軟腐病的發(fā)生，這與彭旋等[33]采用白薇提取液處理意大利青霉，降低了菌絲體蘋(píng)果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性的研究結(jié)果一致。此外，通過(guò)觀(guān)察ACS稀釋液對(duì)已接種匍枝根霉的水蜜桃果實(shí)的防治效果發(fā)現(xiàn)，ACS溶液對(duì)水蜜桃軟腐病具有一定的防治效果，且稀釋倍數(shù)越低，防治效果越好。

本研究結(jié)果表明，ACS稀釋液能夠有效抑制匍枝根霉的生長(zhǎng)，一方面通過(guò)破壞匍枝根霉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其滲透性增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，菌體不能正常生長(zhǎng)而死亡；另一方面ACS稀釋液能夠降低匍枝根霉的細(xì)胞壁降解酶和三羧酸循環(huán)中相關(guān)呼吸和能量代謝酶的活性，延緩和抑制了匍枝根霉對(duì)細(xì)胞壁的降解速率，減少對(duì)水蜜桃果實(shí)的侵染能力，因此可用于采后桃果實(shí)軟腐病害的防治。

ACS處理對(duì)水蜜桃采后匍枝根霉具有一定的抑制作用，但ACS在未來(lái)的研究與應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題和爭(zhēng)議：1)ACS安全無(wú)毒，但因其制備原料中包含有濃硫酸，且防腐保鮮知識(shí)沒(méi)有普及和推廣，廣大消費(fèi)者暫時(shí)還不能接受和認(rèn)同將其應(yīng)用于食物的防腐保鮮中；2)ACS是ⅡA族絡(luò)合物，具有緩腐蝕性即溶液中高濃度的氫離子是緩慢釋放，因此配置的稀釋液在放置過(guò)程中pH值會(huì)發(fā)生浮動(dòng)，但不會(huì)變化太大；3)ACS的作用機(jī)理并不單一，具有酸化功效、殺菌抑菌、去除生物毒素、防褐變和保水性等作用機(jī)理，在研究應(yīng)用過(guò)程中較為復(fù)雜；4)國(guó)內(nèi)外將ACS應(yīng)用于果蔬防腐保鮮的研究應(yīng)用較少，對(duì)其他果蔬采后致病菌是否均有抑菌或殺菌特性，以及具有顯著抑菌效果的稀釋倍數(shù)梯度范圍尚需進(jìn)一步確定。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，ACS稀釋液對(duì)水蜜桃采后軟腐病的防治有良好的效果，不同稀釋倍數(shù)的ACS溶液對(duì)匍枝根霉均有不同程度的抑菌作用，其中ACS-10-3處理組的抑菌效果最強(qiáng)，能夠破壞匍枝根霉細(xì)胞膜滲透性，抑制纖維素酶、果膠酶等致病酶活性，降低琥珀酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶活性，同時(shí)使其對(duì)桃果實(shí)的致病性減弱；ACS稀釋液可顯著降低損傷接種桃果實(shí)的匍枝根霉病斑面積和接種發(fā)病率，能有效抑制采后桃果因病原菌侵染引起的腐爛變質(zhì)，減少經(jīng)濟(jì)損失，延長(zhǎng)保鮮期和改善貯藏品質(zhì)。本研究結(jié)果為ACS溶液應(yīng)用于桃果采后病害防治和防腐保鮮中提供了理論依據(jù)。