K562白血病細(xì)胞中Musashi2干擾慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定

張慧娟，胡 蓉，江麗霞

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000)

Musashi 2 (Msi2)是一進(jìn)化上高度保守的RNA結(jié)合蛋白[1]，可以與靶蛋白的mRNA3' 非翻譯區(qū)(3' UTR)結(jié)合，抑制其下游靶基因的翻譯[2]。作為細(xì)胞命運(yùn)決定子，Msi2可調(diào)控多種組織細(xì)胞的不對(duì)稱分裂，影響干細(xì)胞功能[3]。最近有研究表明，Msi2可以維持人造血干祖細(xì)胞的自我更新并促進(jìn)其體外增長(zhǎng)[4-6]，Msi2的缺失會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞的定向分化[7]。而Kharas等[8]發(fā)現(xiàn)，Msi2不僅在造血干細(xì)胞中高表達(dá)，抑制早期粒系和巨核系的分化，而且參與調(diào)控白血病的發(fā)生發(fā)展。Msi2可以維持骨髓增生異常綜合征(myelodyplastic syndrome，MDS)干細(xì)胞活性并和MDS病人預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]；在急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)中，無(wú)論是在mRNA還是蛋白水平，Msi2的高表達(dá)均與病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[8,10]。在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)小鼠模型中，Msi2的表達(dá)在加速期或急變期顯著高于慢性期[8,11]，過(guò)表達(dá)Msi2可促使CML由慢性期進(jìn)入急變期；反之，急變期CML細(xì)胞中Msi2下調(diào)或缺失可以促使白血病細(xì)胞分化，小鼠生存率增加[11]。臨床資料顯示，高表達(dá)Msi2的CML病人預(yù)后往往不良，Msi2已成為CML早期預(yù)后標(biāo)志之一[8,11]。以上研究表明，Msi2在白血病的惡性轉(zhuǎn)變中起重要的作用。

本文通過(guò)構(gòu)建干擾Msi2的慢病毒載體，包裝成病毒后感染CML細(xì)胞株K562細(xì)胞，并進(jìn)一步檢測(cè)Msi2在K562細(xì)胞中的干擾效率，為以后研究Msi2在白血病中的功能和機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑嘌呤霉素購(gòu)自Sigma公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑和定量PCR試劑TaqMan Real-Time PCR Master Mixes購(gòu)自Invitrogen公司，MSI2抗體購(gòu)自Abcam公司，Tublin抗體購(gòu)自Bioworld公司，辣根過(guò)氧化物酶連接羊抗兔二抗購(gòu)自中杉金橋公司，RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。

1.2質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞培養(yǎng)GV 248慢病毒載體、pHelper 1.0、pHelper 2.0病毒包裝輔助載體購(gòu)自吉?jiǎng)P公司，DH5α大腸桿菌，慢病毒包裝細(xì)胞293T細(xì)胞、人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞均由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院研究中心保存。在37 ℃，5% CO2的條件下用含10%的胎牛血清，青霉素(100 U·mL-1)、鏈霉素(100 U·mL-1)和L-谷氨酰胺(2 mol·L-1)的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)K562細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細(xì)胞。

1.3GV248-shMsi2載體構(gòu)建由吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)合成兩組Msi2干擾片段和對(duì)照組片段，序列分別為shMsi2-1：5'ccggGAATGAAGATGTTGTGGAGAActcgag TTCTCCACAACATCTTCATTCtttttg3'，其中GAATGAAGATGTTGTGGAGAA為靶序列；shMsi2-2：5' ccggAGGCACAGAGGGTTTGGCTTTctcgagAAAGCCAAA CCCTCTGTGCCTtttttg3'，其中AGGCACAGAGGGTT TGGCTTT為靶序列；對(duì)照組(NC)片段序列為：5' TTCTCCGAACGTGTCACGT3'。通過(guò)連接，轉(zhuǎn)化，鑒定和測(cè)序(送至吉?jiǎng)P公司)，獲得連接正確的載體。

1.4轉(zhuǎn)染、感染和篩選將GV248-shMsi2載體或GV248-NC載體分別與pHelper 1.0、pHelper 2.0病毒包裝載體用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染于融合度達(dá)60%的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h和72 h獲取細(xì)胞上清，通過(guò)旋轉(zhuǎn)離心法將病毒液與K562細(xì)胞共培養(yǎng)，隨后用含嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GV248-shMsi2載體的K562細(xì)胞，方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

1.5定量PCR檢測(cè)收集各組K562細(xì)胞，PBS洗滌后用RNA提取試劑提取總RNA，按試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，為定量PCR做準(zhǔn)備。定量PCR總體系包括：TaqMan Real-Time PCR Master Mixes，去離子水，PCR上游引物，PCR下游引物，模板cDNA。Msi2上游引物： 5' GTTATCTGCGAACACAGTAGTG3'; 下游引物：5' ACCCTCTGTGCCTGTTGGTAG3'；gapdh上游引物：5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3'; 下游引物：5' GAAGATGGTGATGGGATTTC3'。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃ 30 s; 變性95 ℃30 s，退火20 s, 延伸72 ℃ 30 s，72 ℃采集熒光，共39個(gè)循環(huán)。融解曲線條件：(65 ～ 95 ) ℃每上升0.5 ℃采集1 次熒光，結(jié)果用2-△△CT表示。

1.6westernblot檢測(cè)收集各組K562細(xì)胞，PBS洗滌后，加入預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液和PMSF(RIPA∶PMSF體積比=100∶1)。在振蕩器上震蕩，充分裂解后，離心12 000 g ×5 min。上清液即為細(xì)胞總蛋白溶液。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣Buffer，混勻后沸煮5 min，-80 ℃保存。取總蛋白20 μg經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。放入5%BSA室溫封閉2 h，加入TBST稀釋的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。加入TBST稀釋的二抗，室溫孵育2 h，再按前述方式洗膜。用ECL化學(xué)檢測(cè)試劑顯影。

2 結(jié) 果

2.1GV248-shMsi2重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定將酶切后的GV248-shMsi2重組質(zhì)粒送DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中包含干擾靶序列和保護(hù)堿基。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，GV248-shMsi2-1質(zhì)粒的測(cè)序完全測(cè)通，與目標(biāo)序列一致，表明成功構(gòu)建GV248-shMsi2-1重組質(zhì)粒。但GV248-shMsi2-2質(zhì)粒的測(cè)序中斷，在測(cè)序經(jīng)過(guò)shRNA靶序列時(shí)中斷。在挑取另外一個(gè)單克隆送測(cè)序后，結(jié)果依舊如此。后續(xù)實(shí)驗(yàn)依舊保留GV248-shMsi2-2質(zhì)粒，待干擾效率出來(lái)后處理。

A代表GV248-shMsi2-1質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果；B代表GV248-shMsi2-2質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果。

2.2下調(diào)Msi2后K562細(xì)胞內(nèi)Msi2mRNA水平表達(dá)在K562細(xì)胞中，和對(duì)照組比較，shMsi2-1和shMsi2-2組中Msi2 mRNA水平均下降，分別降為對(duì)照組的3%和28%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。為方便后續(xù)試驗(yàn)，本研究選取了干擾效率較強(qiáng)的shMsi2-1組作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，即為shMsi2組。

圖2 干擾Msi2后K562細(xì)胞內(nèi)Msi2 mRNA的表達(dá)

2.3下調(diào)Msi2后K562細(xì)胞內(nèi)Msi2蛋白水平表達(dá)圖3顯示，在K562細(xì)胞中，和對(duì)照組比較，shMsi2組中Msi2蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 干擾Msi2后K562細(xì)胞內(nèi)Msi2蛋白表達(dá)

3 討 論

目前，研究發(fā)現(xiàn)Msi2和多種白血病的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)，比如在成人B淋巴細(xì)胞白血病中，高M(jìn)si2表達(dá)的病人往往預(yù)后也越差[13]。在髓系白血病中，Msi2可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞代謝基因來(lái)促進(jìn)白血病的進(jìn)展[14]。因此，深入探究Msi2在白血病細(xì)胞中的功能及機(jī)制顯得尤為重要，其中，成功構(gòu)建干擾Msi2的白血病細(xì)胞模型是關(guān)鍵。白血病細(xì)胞作為懸浮細(xì)胞，存在難轉(zhuǎn)染和感染效率低下的問(wèn)題?；趯?shí)驗(yàn)技術(shù)的成熟度，前期研究[15]是通過(guò)構(gòu)建干擾Msi2的腺病毒載體來(lái)感染白血病細(xì)胞，雖然也能夠達(dá)到下調(diào)白血病細(xì)胞中Msi2的表達(dá)，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)，但也存在一些問(wèn)題：因?yàn)橄俨《靖腥臼撬矔r(shí)感染，因此在構(gòu)建干擾Msi2的細(xì)胞模型時(shí)都必須重新感染；腺病毒用量大，熒光背景高，雜質(zhì)也多；干擾效率不及慢病毒載體。

本文構(gòu)建2個(gè)干擾Msi2的慢病毒載體，GV248-shMsi2-1和GV248-shMsi2-2。在測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，GV248-shMsi2-1載體完全測(cè)通，但GV248-shMsi2-2載體測(cè)序中斷，挑取另外一個(gè)克隆后測(cè)序，仍然是測(cè)序中斷。究其原因，可能是oligo退火后形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響了測(cè)序，也可能是shMsi2-2的高GC含量(shMsi2-2的GC含量是52.38%而shMsi2-1的是38.10%)影響了測(cè)序。由于shMsi2-2測(cè)序已測(cè)出的前半部分序列是與目標(biāo)序列相一致，因此本研究仍將GV248-shMsi2-2載體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，shMsi2-2組干擾效率達(dá)到72%。由此表明GV248-shMsi2-2也是一個(gè)有效的干擾載體。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行病毒包裝并通過(guò)藥物穩(wěn)篩獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GV418-shMsi2載體的白血病細(xì)胞。穩(wěn)篩后的細(xì)胞可擴(kuò)增后長(zhǎng)期保存，以后隨用隨取，避免多次感染的繁瑣。此外，本文結(jié)果也表明：無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平，采用干擾Msi2的慢病毒載體，其干擾效率非常高，幾乎可以達(dá)到100%。因此，在白血病細(xì)胞中做基因功能研究時(shí)，最好采用慢病毒或與之類似的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

本文成功構(gòu)建了干擾Msi2的慢病毒載體，并顯著沉默了K562細(xì)胞中Msi2的表達(dá)，為后續(xù)探究Msi2在白血病中的功能和作用機(jī)理提供技術(shù)支持。