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    氧化應(yīng)激影響肝癌細胞糖異生關(guān)鍵基因表達的作用

    2019-07-25 03:37:02胡澤明康川川袁邵強周雯娜鐘田雨鐘佳寧
    關(guān)鍵詞:糖異生氧化應(yīng)激肝癌

    肖 靖,胡澤明,康川川,袁邵強,周雯娜,黃 菲,陳 斌,鐘田雨,鐘佳寧

    (贛南醫(yī)學(xué)院 1.2016級本科生;2.2017級碩士研究生;3.2016級碩士研究生;4.2015級本科生;5.科研中心;6.第一附屬醫(yī)院,江西 贛州 341000)

    氧化應(yīng)激(Oxidative stress)是指在病理狀態(tài)下,活性氧產(chǎn)生量超過了內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力,過多的自由基(如羥基自由基,超氧陰離子)堆積,使宿主一些生物大分子物質(zhì),如DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等產(chǎn)生氧化作用[1]。普遍認為,氧化應(yīng)激的異常升高在體內(nèi)可能產(chǎn)生一種負面作用,并被認為是導(dǎo)致衰老和慢性疾病(心血管疾病、動脈粥樣硬化、代謝紊亂等)的一個重要誘導(dǎo)因素[2]。糖異生主要在肝[3]、腎[4]、小腸[5]中等通過一系列酶促反應(yīng)利用代謝中間產(chǎn)物(如乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等)重新合成葡萄糖,以維持空腹機體的基礎(chǔ)血糖水平。在空腹?fàn)顟B(tài)下肝臟通過糖異生輸出葡萄糖量約占全身血糖供應(yīng)量的65%[6],因此在肝細胞(包括肝癌細胞)中糖異生反應(yīng)對血糖水平的調(diào)控(包括吸收血糖、糖原轉(zhuǎn)化和糖異生及輸出)具有重要作用。各種病因?qū)е碌母闻K氧化應(yīng)激水平升高常引起糖代謝異常,而糖代謝異常則影響肝臟疾病本身的病程進展和預(yù)后[7]。因此,我們深入研究氧化應(yīng)激如何調(diào)控糖代謝的作用機制有重要的意義。

    GLUT4和G6PC兩個關(guān)鍵基因在調(diào)控糖異生反應(yīng)中起著重要作用。其中,GLUT4蛋白在肝癌細胞中具備類似于骨骼肌、心肌的應(yīng)激轉(zhuǎn)運能力,其能夠在應(yīng)激狀態(tài)下負責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運并在肝糖原的快速恢復(fù)過程中扮演著重要角色[8]。研究表明,在負責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(Gluts)中唯有成員GLUT4能夠在機體應(yīng)激狀態(tài)下?lián)纹咸烟寝D(zhuǎn)運工作,提供機體在應(yīng)激狀態(tài)下所需的能量。GLUT4總蛋白水平與肝糖原濃度存在反比關(guān)系,即當(dāng)肝糖原濃度較低時GLUT4存在過表達,而肝糖原濃度較高時GLUT4低表達[9]。而葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)在糖代謝中也是參與糖異生和糖原分解過程的關(guān)鍵酶之一,廣泛分布于糖異生活躍的器官與組織中[10]。G6Pase可催化糖異生和糖原分解中的最后一步反應(yīng),是肝葡萄糖生成的最后一步關(guān)鍵酶。

    在肝臟中有多種轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控G6PC基因和GLUT4基因的表達。FOXO家族的一個關(guān)鍵成員,即叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O 1,F(xiàn)OXO1)便是第一個被證明有此功能的轉(zhuǎn)錄因子[11]。在肝臟中,胰島素可以通過激活A(yù)KT抑制肝糖異生[12],激活的AKT隨后在多個位點使FOXO1磷酸化,磷酸化的FOXO1與某些伴侶蛋白有更高的結(jié)合力,以便FOXO1從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì),結(jié)果導(dǎo)致糖異生被抑制[13]。另有研究表明,F(xiàn)OXO1可以調(diào)節(jié)多種細胞活動如細胞凋亡與自噬、免疫調(diào)節(jié)及能量代謝[14]。FOXO1蛋白還參與其他的多種細胞功能,比如細胞增殖、衰老及對糖異生的應(yīng)激抗性[15]。因此,F(xiàn)OXO1也是維持細胞生命活動的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

    本研究擬通過H2O2處理HepG2肝癌細胞,模擬細胞氧化應(yīng)激環(huán)境,觀察其在肝癌細胞中如何調(diào)控糖異生基因(G6PC、GLUT4)的表達變化并揭示其潛在作用機制。通過該研究能夠發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中氧化應(yīng)激對糖異生基因的影響,有助于深入了解肝癌細胞的代謝調(diào)控過程,為進一步研究氧化應(yīng)激如何誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤代謝機制提供理論支撐。

    1 材料與方法

    1.1細胞與主要試劑HepG2細胞株從中國科學(xué)院細胞庫購得。實驗所需主要試劑有RPMI1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和細胞裂解液Trizol(美國Invitrogen公司);30%H2O2(武漢純度生物公司);SYBR Green試劑(美國Roche公司);FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Fermentas公司);兔抗G6PC、GLUT4和FOXO1抗體(美國Millipore公司);鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)鼠抗和兔抗(美國Sigma公司);熒光羊抗兔偶聯(lián)抗體(美國Abcam公司)。qRT-PCR引物序列:G6PC.S GCAGGTGTATACTACGTGATGGT, G6PC.A GACATTCAAGCACCGAAATCTG;GLUT4.S GGGAAGGAAAAGGGCTATGCTG, GLUT4.A CAATGAGGAACCGTCCAAGAATG。

    1.2細胞培養(yǎng)及藥物處理HepG2細胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),其培養(yǎng)基用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清、100 μg·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素),每2天進行傳代或保種。對照組用RPMI1640培養(yǎng)基處理,實驗組用配制好的H2O2(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)處理。

    1.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)將HepG2細胞傳于6孔盤,在對數(shù)生長期給藥處理,分為濃度梯度組2 h(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)和時間梯度組2 mmol·L-1(0 h、1 h、2 h、4 h)兩組。給藥完成后消化細胞,取細胞沉淀用細胞裂解液(Trizol)提取RNA,并檢測RNA濃度和純度,用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA后通過SYBR Green試劑進行PCR擴增,再用GraphPad軟件進行數(shù)據(jù)處理。

    1.4WesternBlot將HepG2細胞傳于6孔盤,在對數(shù)生長期給藥處理,分為濃度梯度組2 h(0 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)和時間梯度組2 mmol·L-1(0 h、2 h、4 h)兩組。給藥完成后消化細胞,取細胞沉淀制備成蛋白樣品,上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、以250 mA恒流90 min轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入G6PC、GLUT4或者β-Actin抗體,4 ℃過夜。TBST輕洗3次遍后加入二抗室溫孵育90 min,再用TBST清洗3遍后加入發(fā)光劑、顯影、定影,定量分析H2O2處理前后G6PC和GLUT4的蛋白表達。

    1.5免疫熒光實驗備好滅菌的蓋玻片置于6孔盤中。將HepG2細胞傳于6孔盤中的6個格孔,使細胞貼壁于蓋玻片上,并將其分為3個對照組(RPMI1640處理)和3個實驗組(2 mmol·L-1H2O2處理)。在蓋玻片上生長的細胞用4%冰甲醇固定保持5 min,并用5%BSA/PBS封閉30 min。然后用一抗孵育細胞常溫1 h,再用PBST清洗3次,每次10 min。隨后,用熒光偶聯(lián)二抗孵育并進行相同的洗脫過程,最后用DAPI染核并洗脫,封片然后通過共聚焦顯微鏡下進行觀察。

    2 結(jié) 果

    2.1H2O2對糖異生關(guān)鍵基因G6PC和GLUT4轉(zhuǎn)錄表達的影響在H2O2處理的條件下,定量分析G6PC和GLUT4轉(zhuǎn)錄表達的情況,因此在傳有HepG2細胞的6孔盤里加入2 mmol·L-1的H2O2分別處理不同時間(0 h、1h、2 h、4 h),提取RNA進行qRT-PCR檢測,如圖1A 所示,G6PC和GLUT4的mRNA相對表達量隨時間梯度顯著增高,但GLUT4的表達量在持續(xù)4 h H2O2處理后逐漸恢復(fù);以及加入不同濃度(0 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)的H2O2分別處理2 h,提取RNA進行qRT-PCR檢測,如圖1B所示,G6PC和GLUT4的mRNA相對表達量隨濃度梯度而增加。以上結(jié)果證明,糖異生關(guān)鍵基因G6PC和GLUT4轉(zhuǎn)錄表達是依賴于細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

    2.2H2O2作用HepG2肝癌細胞后G6PC和GLUT4蛋白水平的變化在H2O2處理的條件下,定量分析G6PC和GLUT4蛋白表達的情況,因此在傳有HepG2細胞的6孔盤里加入不同濃度(0 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)的H2O2分別處理2 h,提取樣本進行Western蛋白印跡檢測,如圖2A所示,G6PC和GLUT4的蛋白相對表達隨濃度梯度顯著降低;以及加入2 mmol·L-1的H2O2處理不同時間(0 h、2 h、4 h),提取樣本進行Western蛋白印跡檢測,實驗結(jié)果如圖2B所示,G6PC和GLUT4的蛋白相對表達隨時間梯度顯著降低。實驗證明,細胞內(nèi)氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)G6PC和GLUT4蛋白水平的降低。為了驗證在氧化應(yīng)激條件下,HepG2肝癌細胞的G6PC和GLUT4蛋白表達會受到影響,因此用免疫熒光實驗觀察G6PC和GLUT4在細胞內(nèi)的定位情況及蛋白表達情況。細胞貼于蓋玻片后給予含H2O2的培養(yǎng)基1 mL,使H2O2終濃度為2 mmol·L-1,處理時間為2 h。如圖3所示,H2O2處理后G6PC和GLUT4整體熒光亮度較對照組減弱,但核內(nèi)熒光亮度較對照組稍強。綜上,通過Western Blot和免疫熒光實驗我們都證明細胞內(nèi)氧化應(yīng)激確實能誘導(dǎo)G6PC和GLUT4蛋白水平的降低。

    2.3H2O2對糖異生關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXO1蛋白在細胞內(nèi)定位表達的影響為了驗證氧化應(yīng)激對G6PC和GLUT4基因表達是通過影響其上游轉(zhuǎn)錄因子的表達而進行調(diào)控,因此用免疫熒光實驗觀察FOXO1在細胞內(nèi)的定位情況。細胞貼于蓋玻片后給予含H2O2的培養(yǎng)基1 mL,使H2O2終濃度為2 mmol·L-1,處理時間為2 h。如圖4所示,H2O2處理后FOXO1胞質(zhì)熒光亮度較對照組增強,核內(nèi)熒光亮度較對照組減弱。實驗證明,氧化應(yīng)激確實會誘導(dǎo)FOXO1從細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)。這一定位的改變會導(dǎo)致其調(diào)控功能的轉(zhuǎn)換。

    (A)qRT-PCR檢測用2 mmol·L-1 H2O2處理不同時間梯度的G6PC和GLUT4基因的mRNA相對表達量;

    (A)Western Blot檢測用不同濃度梯度的H2O2處理2 h后G6PC和GLUT4的蛋白表達;

    (A)使用G6PC抗體對用或不用H2O2處理的HepG2肝癌細胞進行免疫熒光染色,細胞核用DAPI染色;

    使用FOXO1抗體對用或不用H2O2處理的HepG2肝癌細胞

    3 討 論

    長期以來,有大量研究揭示了肝癌細胞與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系,比如辣椒素能劑量依賴性誘導(dǎo)HepG2 肝癌細胞的凋亡,其機制與氧化應(yīng)激水平過激活相關(guān)[16];雷公藤甲素刺激了肝癌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生,從而使細胞發(fā)生凋亡[17]。但目前氧化應(yīng)激對肝癌細胞糖代謝方面的研究知之甚少,因此,為了研究氧化應(yīng)激在肝癌細胞中調(diào)控糖異生的作用機制,我們設(shè)計H2O2來模擬氧化應(yīng)激環(huán)境,檢測HepG2 肝癌細胞中的糖異生關(guān)鍵基因的表達情況,我們的結(jié)果顯示,G6PC和GLUT4的轉(zhuǎn)錄表達增高,而蛋白表達降低;以及FOXO1蛋白含量在胞質(zhì)里明顯增高。這些實驗結(jié)果表明了氧化應(yīng)激能促進肝癌細胞FOXO1蛋白的表達,從而上調(diào)G6PC和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄,進一步證實了氧化應(yīng)激能促進糖異生的發(fā)生。但由于在氧化應(yīng)激條件下,細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可能通過構(gòu)象改變而受到破壞或降解[18],因此在我們的實驗中,G6PC和GLUT4的蛋白表達是降低的,這與它們的轉(zhuǎn)錄表達增高并不矛盾。

    已有研究表明FOXO1可以通過激活多種基因的表達來促進糖異生,它的活性與其翻譯后修飾緊密相關(guān),其中包括磷酸化、泛素化和乙?;痆19]。FOXO1蛋白分布在細胞核和細胞質(zhì)組分中,細胞核中的非磷酸化FOXO1蛋白可以激活各種糖異生基因的轉(zhuǎn)錄,當(dāng)FOXO1磷酸化后,它從細胞核移位至細胞質(zhì),從而導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性喪失[20]。有體外實驗表明,氧化應(yīng)激增強了FOXO1蛋白的表達,并抑制FOXO1蛋白磷酸化,隨后增強了PEPCK的表達[21]。PEPCK是糖異生調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶以及FOXO1的下游效應(yīng)因子,降糖藥物可以通過抑制FOXO1來降低PEPCK的表達,從而實現(xiàn)線粒體功能的增強以及控制肝臟中的血糖保持在穩(wěn)定水平[22]。另有研究表明,氧化應(yīng)激增強了FOXO1在多核巨細胞中的轉(zhuǎn)錄活性,增強了FOXO1在胞質(zhì)中的表達[23]。在我們的細胞實驗中,氧化應(yīng)激導(dǎo)致部分FOXO1蛋白定位從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi),從而增強了糖異生G6PC和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄,這與他們的實驗結(jié)果相似。

    FOXO1還參與2型糖尿病(T2DM)患者的胰島素抵抗和細胞因子介導(dǎo)的β細胞衰竭,并導(dǎo)致糖異生、細胞凋亡、不受控制的自噬以及細胞周期停滯[24]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)抗糖尿病藥物和AM251可以通過抑制FOXO1來下調(diào)PEPCK和G6PC的表達,從而控制肝臟中的血糖保持在穩(wěn)定水平[25]。與此相似的是,我們的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以促進腫瘤細胞的FOXO1表達增高,從而上調(diào)G6PC和GLUT4的表達,于是可以推測某些抗氧化應(yīng)激藥物可能會抑制腫瘤細胞糖異生的發(fā)生,這可能為治療伴有2型糖尿病的腫瘤患者提供了一種重要理論依據(jù)。但由于體外實驗不能完全模擬體內(nèi)實驗的氧化應(yīng)激環(huán)境,我們的實驗結(jié)果受到一定程度的限制,未來我們將構(gòu)建小鼠模型來展開進一步的研究。

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