基于TG酶凝固的大豆蛋白凝膠生產(chǎn)工藝研究

孫 菁 ， 趙良忠 ，3，王 容 ，沈國祥

（1.邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽 422000；2.湖南省果蔬清潔加工工程技術(shù)研究中心，湖南邵陽 422000；3.豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地，湖南邵陽 422000）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，簡稱TG酶）是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，蛋白質(zhì)和肽鍵中谷氨酞胺殘基的γ-羧酰胺基為酞基供體[1-2]。不同來源的原料TG酶處理?xiàng)l件不一樣，如魚肉TG酶最適pH值7.5，最適溫度30℃；豚鼠肉TG酶最適pH值6.0，最適溫度50～65℃；微生物TG酶最適pH值6.0～7.0，最適溫度50℃[3-6]。目前，TG酶在肉制品、乳制品和植物蛋白制品加工及環(huán)保型膠黏劑等多方面均有應(yīng)用[7-8]。在豆制品生產(chǎn)中常以TG酶作為凝固劑。

蛋白質(zhì)經(jīng)過解離、變性，暴露出用于分子間交聯(lián)的功能基團(tuán)，在合適的條件下，相鄰的蛋白分子通過化學(xué)作用力結(jié)合到一起形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，成為凝膠[9-10]。凝膠作用是蛋白質(zhì)最重要的加工功能性質(zhì)之一[11]，豆腐便是經(jīng)過大豆蛋白凝膠加工而成[12]，加熱、酸、鹽和酶均可誘導(dǎo)形成大豆蛋白凝膠。大豆蛋白的主要蛋白組成是球蛋白，包括大豆豆球蛋白（glycinin） 和以主要7S球蛋白[13-16]形式存在β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）。大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量不僅是豆腐的品質(zhì)指標(biāo)[17]，還是反應(yīng)大豆蛋白的凝固狀態(tài)、決定最終豆腐的質(zhì)構(gòu)特性。試驗(yàn)以大豆蛋白凝膠保水性、水分含量和質(zhì)構(gòu)特性為指標(biāo)，研究TG酶對(duì)大豆蛋白凝固特性的影響，探討TG酶對(duì)大豆蛋白凝膠品質(zhì)的影響，為TG酶在豆制品中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白、TG酶，湖南君益福食品有限公司提供；氫氧化鈉標(biāo)定液、酚酞、乙醇溶液、戊烯二醛溶液、OsO4溶液，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī)，澳大利亞達(dá)卡米公司產(chǎn)品；LS型質(zhì)構(gòu)儀，美國阿美特克有限公司產(chǎn)品；MJ33型水分自動(dòng)測定儀，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 凝膠制備

配制4%大豆蛋白溶液[18]，調(diào)節(jié)初始pH值，于95℃下水浴加熱10 min，冷卻至一定反應(yīng)溫度加入TG酶，控制反應(yīng)時(shí)間。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）初始pH值條件試驗(yàn)。分別調(diào)節(jié)大豆蛋白溶液初始pH值至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，固定反應(yīng)溫度50℃，TG酶添加量0.2%，反應(yīng)時(shí)間15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值對(duì)凝膠保水性、水分含量及質(zhì)構(gòu)特性的影響

（2） 反應(yīng)溫度試驗(yàn)。調(diào)節(jié)大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，分別設(shè)置反應(yīng)溫度40，45，50，55，60℃，固定TG酶添加量0.2%，反應(yīng)時(shí)間15 min，探究反應(yīng)溫度對(duì)凝膠保水性、水分含量及質(zhì)構(gòu)特性的影響。

（3）TG酶添加量試驗(yàn)。調(diào)節(jié)大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，設(shè)置反應(yīng)溫度50℃，使TG酶添加量分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，反應(yīng)時(shí)間15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值對(duì)凝膠保水性、水分含量及質(zhì)構(gòu)特性的影響。

（4） 反應(yīng)時(shí)間試驗(yàn)。調(diào)節(jié)大豆蛋白溶液初始pH值至5.0，設(shè)置反應(yīng)溫度50℃，固定TG酶添加量0.4%，控制反應(yīng)時(shí)間分別為10，15，20，25，30 min，探究大豆蛋白反應(yīng)時(shí)間對(duì)凝膠保水性、水分含量及質(zhì)構(gòu)特性的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇初始pH值（A）、反應(yīng)溫度（B）、TG酶添加量（C） 和反應(yīng)時(shí)間（D）4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，通過保水性和水分含量選出TG酶凝固條件最佳工藝組合。

1.3.4 凝膠腐保水性測定[19]

稱取3 g（精確到0.000 1 g） 凝膠樣品放置于底部墊有脫脂棉的離心管中，以轉(zhuǎn)速1 200 r/min離心10 min，離心后稱量上層凝膠的質(zhì)量（W1），此后將此樣品置于105℃下干燥至恒質(zhì)量（W0）。持水率計(jì)算公式為：

1.3.5 凝膠水分含量測定

稱取2 g樣品放置于水分自動(dòng)測定儀，測定完成后記錄數(shù)據(jù)。

1.3.6 凝膠質(zhì)構(gòu)特性測定[20]

取凝膠中心部分切成長寬高分別1 cm正方體的樣品，采用二次壓縮方法測定質(zhì)構(gòu)。用P35圓柱形平底探頭，測前、測中、測后速度分別40，30，40 mm/s，下壓距離40%，停留時(shí)間5 s，觸發(fā)力0.05 N。同一個(gè)樣品選3個(gè)不同部分進(jìn)行測試，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH值試驗(yàn)

初始pH值對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響見圖1，初始pH值對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響見圖2。

圖1 初始pH值對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響

圖2 初始pH值對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

如圖1所示，隨著初始pH值的增大，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量均呈先上升后下降的趨勢，在pH值5.0時(shí)有最大值，變化顯著。大豆蛋白在等電點(diǎn)（pH值4.2～4.6）附近迅速聚集沉淀，蛋白質(zhì)分子之間有序性降低[21]。蛋白質(zhì)分子可能更容易與水分子結(jié)合，進(jìn)而包裹更多水分子。在TG酶的作用下大豆蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)作用加強(qiáng)，凝膠結(jié)構(gòu)緊密，保水性提高，水分含量增大。TG酶的最適pH值為5～8時(shí)有較高活性，過于酸性的環(huán)境會(huì)使TG酶活性降低，從而降低TG酶與大豆蛋白分子之間的交聯(lián)作用，不利于大豆蛋白分子與水分子的結(jié)合。由圖2可知，硬度和咀嚼性隨著初始pH值的增大呈先增大后減小的趨勢，在初始pH值5.0時(shí)有最大值；彈性和內(nèi)聚性變化趨勢不規(guī)律，在初始pH值4.5時(shí)有最大值。初始pH值與質(zhì)構(gòu)指標(biāo)硬度、咀嚼性和內(nèi)聚性有顯著性差異（p＜0.05），與彈性無顯著性差異。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)凝膠品質(zhì)的影響

反應(yīng)溫度對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響見圖3，反應(yīng)溫度對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響見圖4。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

如圖3所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量變化一致，均呈先上升后下降的趨勢，在55℃時(shí)為最大值，變化顯著。大豆蛋白預(yù)先在95℃下水浴加熱10 min保證變性充分（蛋白質(zhì)解熱溫度過高會(huì)發(fā)生熱降解，從而使蛋白質(zhì)失去凝膠能力），使蛋白質(zhì)的巰基基團(tuán)及疏水區(qū)域大部分暴露出來[22]，加入TG酶后更容易發(fā)生交聯(lián)作用，大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)緊密，保水性好，水分含量高。TG酶的最適溫度在45～55℃，溫度過高TG酶活性下降，與蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用減弱，形成的凝膠結(jié)構(gòu)部松散、保水性低。由圖4可知，硬度和咀嚼性隨著反應(yīng)溫度的上升呈先增大后減小的趨勢，在反應(yīng)溫度45℃時(shí)為最大值；彈性和內(nèi)聚性變化趨勢不規(guī)律，在反應(yīng)溫度50℃時(shí)為最大值。反應(yīng)溫度與質(zhì)構(gòu)指標(biāo)硬度、咀嚼性、彈性有顯著性差異（p＜0.05），與內(nèi)聚性無顯著性差異。

2.3 TG酶添加量對(duì)凝膠品質(zhì)的影響

TG酶添加量對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響見圖5，TG酶添加量對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響見圖6。

圖5 TG酶添加量對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響

圖6 TG酶添加量對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

如圖5所示，隨著TG酶添加量的增大，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量先緩慢上升，在0.4%有最大值，隨后下降，變化顯著。大豆蛋白穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)由于TG酶發(fā)生交聯(lián)作用變得不穩(wěn)定，暴露出的大量疏水區(qū)域在疏水作用下進(jìn)一步交聯(lián)聚集，從而形成凝膠。但Sakamoto H等人[23]研究發(fā)現(xiàn)，隨著TG酶添加量的增大，大豆蛋白質(zhì)分子表面的作用位點(diǎn)可能很快被交聯(lián)而降低了TG酶與蛋白分子交聯(lián)的幾率[24]，從而形成的蛋白質(zhì)分子間凝膠結(jié)構(gòu)少而松散。松散的結(jié)構(gòu)使蛋白凝膠的保水性相對(duì)降低，水分含量減少。由圖6可知，硬度和咀嚼性隨著TG酶添加量的增大呈先增大后減小的趨勢，在TG酶添加量0.4%時(shí)有最大值；彈性和內(nèi)聚性變化趨勢不規(guī)律，在TG酶添加量0.5%時(shí)彈性有最大值。TG酶添加量與質(zhì)構(gòu)指標(biāo)硬度和咀嚼性有顯著性差異（p＜0.05），與彈性和內(nèi)聚性無顯著性差異。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)凝膠品質(zhì)的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響見圖7，反應(yīng)時(shí)間對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響見圖8。

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)凝膠保水性和水分含量的影響

如圖7所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，大豆蛋白凝膠的保水性和水分含量先上升后下降，在20 min有最大值，變化顯著。充分的反應(yīng)時(shí)間使TG酶催化蛋白質(zhì)分子上?；D(zhuǎn)移完全，交聯(lián)作用加強(qiáng)凝膠結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定緊密，保水性增大、水分含量增多。但Howell N K[25]的研究結(jié)果表明，凝固時(shí)間過長會(huì)使蛋白質(zhì)分子上的巰基發(fā)生氧化，進(jìn)而疏水作用減弱導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)松散，保水性減小、水分含量減少。由圖8可知，硬度和咀嚼性隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈先增大后減小的趨勢，在反應(yīng)時(shí)間20 min時(shí)為最大值；彈性和內(nèi)聚性變化趨勢不規(guī)律，在反應(yīng)時(shí)間25 min時(shí)為最大值。反應(yīng)時(shí)間與質(zhì)構(gòu)指標(biāo)硬度和咀嚼性有顯著性差異（p＜0.05），與彈性無顯著性差異。

2.5 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。

采用極差分析法，對(duì)各因素均值及極差大小進(jìn)行分析。由表1可知，TG酶凝固大豆蛋白的4個(gè)條件對(duì)凝膠的保水性和水分含量影響程度相同，主次順序均為C＞A＞B＞D，即TG酶添加量＞初始pH值＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間，即最優(yōu)組合為A2B2C3D2，按此組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，A2B2C3D2組合下凝膠保水性為78.21%，水分含量為84.35%，結(jié)構(gòu)緊致，故A2B2C3D2組合為最優(yōu)組合，即初始pH值5.0，反應(yīng)溫度55℃，TG酶添加量0.5%，反應(yīng)時(shí)間20 min。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.6 凝膠品質(zhì)相關(guān)性分析

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

凝膠品質(zhì)相關(guān)性分析見表2。

根據(jù)表2進(jìn)行凝膠品質(zhì)相關(guān)性分析，保水性與水分含量呈極顯著正相關(guān)（r為0.785），即保水性越大凝膠水分含量越高，這是因?yàn)樗峙c蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合不易流失；保水性與硬度和咀嚼性呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.639，0.581），即保水性越大凝膠的硬度和咀嚼性越大，這是因?yàn)榈鞍拙W(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)包裹較多的水分導(dǎo)致硬度和咀嚼性增大。水分含量與硬度和咀嚼性呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.653，0.581），即水分含量越高硬度和咀嚼性越好，這是因?yàn)樗趾繒?huì)直接影響凝膠強(qiáng)度，進(jìn)而影響凝膠的硬度和咀嚼性。硬度與咀嚼性、彈性和內(nèi)聚性呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.901，0.551，0.835），即硬度越大，咀嚼性、彈性和內(nèi)聚性越好；咀嚼性與彈性和內(nèi)聚性呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.659，0.653），即咀嚼性越大，彈性和內(nèi)聚性越好；彈性與內(nèi)聚性呈顯著正相關(guān)（r為0.489），即彈性越大，內(nèi)聚性越好。質(zhì)構(gòu)特性影響凝膠強(qiáng)度和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而質(zhì)構(gòu)特性間相互影響。

表2 凝膠品質(zhì)相關(guān)性分析

2.7 凝膠品質(zhì)主成分分析

采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

凝膠品質(zhì)主成分分析見表3。

表3 凝膠品質(zhì)主成分分析

對(duì)凝膠品質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA），表3通過方差分解提取出2個(gè)主成分。第一主成分方差累積值能解釋凝膠品質(zhì)信息的64.639%，第二主成分方差累積值能解釋凝膠品質(zhì)信息的18.760%，一共反映了凝膠品質(zhì)絕大部分信息83.399%。

主成分矩陣見表4。

表4 主成分矩陣

根據(jù)表4主成分矩陣分析，第一主成分與硬度和咀嚼性呈顯著性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.965和0.922），且第一主成分可解釋凝膠品質(zhì)信息的大部分，因此硬度和咀嚼性是決定凝膠品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)豆清發(fā)酵液生產(chǎn)條件與TG酶作用大豆蛋白的條件范圍有差異，試驗(yàn)確定了TG酶凝固大豆蛋白的最優(yōu)條件為初始pH值5.0，反應(yīng)溫度55℃，TG酶添加量0.5%，反應(yīng)時(shí)間20 min。通過對(duì)大豆蛋白凝膠品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，除了硬度與彈性呈顯著相關(guān)，硬度和咀嚼性均與其他指標(biāo)均呈極顯著相關(guān)；質(zhì)構(gòu)特性之間相關(guān)性十分復(fù)雜。通過主成分分析，確定硬度和咀嚼性是影響大豆蛋白凝膠品質(zhì)的關(guān)鍵因素。