評(píng)估國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)葡萄球菌和腸球菌體外抗菌活性

于淑穎，肖 盟， 楊文航， 程敬偉，周夢(mèng)蘭，陳新飛，張 戈， 劉亞麗， 楊啟文，孫宏莉， 黃 勛， 伍眾文， 黃文祥， 楊 青， 俞云松， 徐英春

本研究就臨床常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性菌對(duì)中國(guó)江蘇豪森公司研制生產(chǎn)的仿制藥利奈唑胺（商品名恒捷，以下稱(chēng)國(guó)產(chǎn)利奈唑胺）的體外藥物敏感性，與美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)的利奈唑胺（商品名斯沃，以下稱(chēng)進(jìn)口利奈唑胺）進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估國(guó)產(chǎn)利奈唑胺的體外抗菌活性及其與進(jìn)口利奈唑胺的一致 性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 本研究選取2014－2017年皮膚軟組織、呼吸道、血液、腹腔等感染部位分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）、甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌（MSCNS）和VRE各50株，共計(jì)250株。上述菌株收集自中國(guó)多所醫(yī)學(xué)中心：北京協(xié)和醫(yī)院117株、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院45株、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院25株、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院27株、浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院19株和浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院17株。

1.1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 29213和糞腸球菌ATCC 29212標(biāo)準(zhǔn)菌株為質(zhì)控菌株。

1.1.3 試劑與儀器 本研究所用藥物為國(guó)產(chǎn)利奈唑胺（注射液，100 mL：0.2 g），進(jìn)口利奈唑胺（注射液，300 mL：0.6 g），達(dá)托霉素（阿斯利康制藥有限公司，0.5 g/瓶），替加環(huán)素（惠氏制藥有限公司，50 mg/瓶），左氧氟沙星［第一三共（北京）有限公司，注射液，100 mL∶0.5 g］，萬(wàn)古霉素、替考拉寧和苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品從中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買(mǎi)。用于制作微量肉湯稀釋法的陽(yáng)離子調(diào)節(jié)（Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth，CAMHB）干粉為美國(guó)BD公司商品，哥倫比亞血平板購(gòu)自北京欣隆福醫(yī)藥銷(xiāo)售有限公司。MALDI-TOF MS（簡(jiǎn)稱(chēng)VITEK MS）及配套的VITEK MS-CHCA基質(zhì)和靶板購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公 司。

1.2 方法

1.2.1 VITEK MS 入組菌株采用VITEK MS進(jìn)行鑒定，菌落均勻涂布在靶板上，滴加1 μL基質(zhì)，待干燥后放入機(jī)器采集峰圖，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的峰圖比對(duì)得出鑒定結(jié)果及鑒定率，具體操作遵照儀器使用說(shuō)明書(shū)?？尚哦却笥?0%，認(rèn)為鑒定至種水 平。

1.2.2 16S rDNA測(cè)序 對(duì)質(zhì)譜鑒定未出結(jié)果或鑒定率低的菌株，補(bǔ)充16S rDNA的基因擴(kuò)增和測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，所有菌株均鑒定至種的水平。采用煮沸法提取DNA，將菌落挑入200 μL DNA提取液，震蕩混勻，100 ℃水浴10 min后離心，將DNA產(chǎn)物送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100-S26推薦的微量肉湯稀釋法，平行測(cè)定國(guó)產(chǎn)利奈唑胺 、 進(jìn)口利奈唑胺 、萬(wàn)古霉素、替考拉寧、達(dá)托霉素、苯唑西林、替加環(huán)素和左氧氟沙星8種藥物的MIC值。在調(diào)節(jié)過(guò)陽(yáng)離子的CAMHB肉湯中加入氯化鈣使鈣離子終濃度為500 mg/L，以滿(mǎn)足達(dá)托霉素發(fā)揮藥效的環(huán)境。

1.2.4 敏感率和耐藥率計(jì)算 根據(jù)MIC值計(jì)算MIC范圍、MIC50、MIC90和幾何均數(shù)（GM），結(jié)果判讀以CLSI M100-S26推薦折點(diǎn)為判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，比較國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口利奈唑胺藥敏檢測(cè)結(jié)果間的一致性及8種抗菌藥物的抗菌活性。兩種利奈唑胺的一致性通過(guò)分類(lèi)一致率（categorical agreement， CA）（極大錯(cuò)誤、大錯(cuò)誤和小錯(cuò)誤的發(fā)生率）以及基本一致率（essential agreement， EA）進(jìn)行評(píng)價(jià)。CA指待測(cè)藥物與參考藥物判讀結(jié)果的一致率，如二者均判讀為敏感、中介或耐藥[5]。EA指待測(cè)藥物檢測(cè)MIC值與參考藥物完全一致或相差不超過(guò)±1個(gè)稀釋倍數(shù)[6]。

1.2.5 結(jié)果分析 藥敏數(shù)據(jù)分析采用WHONET 5.6版軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 菌株來(lái)源

從6所醫(yī)院收集的MRSA、MSSA、MRCNS、MSCNS、VRE各50株，共計(jì)250株，其中分離自傷口組織和各類(lèi)膿液標(biāo)本占28.4%，血液標(biāo)本占22.0%，呼吸道標(biāo)本占19.6%，尿液標(biāo)本占12.8%，腹水和引流液標(biāo)本占6.0%，胸腔積液占2.8%，腦脊液標(biāo)本占2.0%，其他標(biāo)本占6.4%。72.4%的菌株分離自非重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）住院患者，14.8%的菌株分離自ICU患者，12.8%分離自門(mén)急診患者。

2.2 國(guó)產(chǎn)利奈唑胺的體外抗菌活性

表1顯示250株受試革蘭陽(yáng)性菌對(duì)包括兩種利奈唑胺在內(nèi)的8種抗革蘭陽(yáng)性菌的抗菌藥物的敏感率。其中國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)葡萄球菌和VRE均具有高度的抗菌活性，該藥對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC50和MIC90分別為2 mg/L和4 mg/L，對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌的MIC50和MIC90分別為1 mg/L和2 mg/L，對(duì)VRE的MIC范圍、MIC50和MIC90分別為0.5～2 mg/ L、2 mg/L和2 mg/L?？傮w來(lái)看，本研究納入的全部葡萄球菌和腸球菌均對(duì)國(guó)產(chǎn)利奈唑胺呈現(xiàn)敏感。

2.3 國(guó)產(chǎn)利奈唑胺和進(jìn)口利奈唑胺體外抗菌活性的比較

國(guó)產(chǎn)利奈唑胺和進(jìn)口利奈唑胺對(duì)葡萄球菌和腸球菌的抗菌活性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)50株MSSA的MIC50為2 mg/L，較進(jìn)口利奈唑胺對(duì)MSSA（MIC50=4 mg/L）低一個(gè)稀釋度。此外國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)其他受試葡萄球菌屬細(xì)菌和VRE菌株的MIC范圍、MIC50和MIC90與進(jìn)口利奈唑胺完全相同。各受試細(xì)菌對(duì)國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口利奈唑胺的敏感率均高達(dá)100%（表1）。

表1 兩種利奈唑胺對(duì)250株革蘭陽(yáng)性菌的體外抗菌活性Table 1 In vitro antimicrobial activity of two linezolid products against 250 strains of gram-positive cocci

表1 （續(xù)）Table 1（continued）

2.4 兩種利奈唑胺藥敏測(cè)定結(jié)果的一致性分析

國(guó)產(chǎn)利奈唑胺和進(jìn)口利奈唑胺對(duì)MRSA、MSSA、MRCNS、MSCNS和VRE的抗菌藥物敏感性結(jié)果的CA和EA均高達(dá)100%。國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)全部受試菌株的MIC值與進(jìn)口利奈唑胺相比不超過(guò)±1個(gè)稀釋梯度。兩種利奈唑胺對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌和腸球菌的MIC值基本相同。雖然金黃色葡萄球菌中，國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)8.0%（4/50）的MRSA和22.0%（11/50）的MSSA的MIC值比進(jìn)口利奈唑胺MIC值低1個(gè)稀釋度，但是并不影響CA?？傮w上說(shuō)，兩種利奈唑胺對(duì)MRSA、MSSA、MRCNS、MSCNS和VRE的體外藥敏測(cè)定結(jié)果高度一致（表2）。

2.5 其他抗菌藥物的體外抗菌活性

研究結(jié)果顯示，替加環(huán)素、達(dá)托霉素、萬(wàn)古霉素和替考拉寧對(duì)葡萄球菌具有很好的抗菌活性，除了MRCNS對(duì)替考拉寧的敏感率為88.0%，葡萄球菌對(duì)這4種抗菌藥物的敏感率均高達(dá)100%。相比之下，葡萄球菌對(duì)左氧氟沙星的敏感率明顯低于上述4種抗菌藥物，MRSA和MRCNS對(duì)左氧氟沙星的敏感率（8.0%和34.0%）低于MSSA和MSCNS的敏感率（64.0%和82.0%）。對(duì)于VRE菌株，替加環(huán)素和達(dá)托霉素仍呈現(xiàn)很好的抗菌活性，VRE菌株對(duì)兩藥的敏感率均高達(dá)100%；而對(duì)替考拉寧的敏感率為50%，對(duì)左氧氟沙星全部耐 藥。

3 討論

利奈唑胺對(duì)多重耐藥革蘭陽(yáng)性球菌有良好抗菌活性。朱徳妹等[2]通過(guò)測(cè)定利奈唑胺對(duì)579株臨床分離菌的體外抗菌活性，并與有關(guān)抗菌藥物進(jìn)行比較，認(rèn)為利奈唑胺對(duì)需氧革蘭陽(yáng)性球菌，包括多重耐藥菌具有高度抗菌活性，且與其他抗菌藥物間無(wú)交叉耐藥。提示利奈唑胺對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌，尤其是多重耐藥株所致感染的控制將具有重要作用。利奈唑胺在我國(guó)已于2007年9月用于臨床，目前臨床所應(yīng)用的利奈唑胺多以進(jìn)口為主，隨著我國(guó)醫(yī)藥自主研發(fā)的不斷投入，許多進(jìn)口藥物相繼在我國(guó)可以自主合成。

表2 兩種利奈唑胺對(duì)250株革蘭陽(yáng)性菌的MIC值比較以及一致率評(píng)價(jià)Table 2 Consistency of MIC values against 250 strains of gram-positive cocci compared between domestic linezolid and original linezolid

本研究結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有極好的體外抗菌活性，250株革蘭陽(yáng)性菌株對(duì)國(guó)產(chǎn)利奈唑胺均呈現(xiàn)敏感狀態(tài)。同時(shí)，本研究顯示國(guó)產(chǎn)利奈唑胺與進(jìn)口利奈唑胺對(duì)受試菌株的體外抗菌活性結(jié)果高度一致， 雖然有18株菌株（7.2%，18/250）的MIC值出現(xiàn)了不一致，但是僅相差±1個(gè)濃度梯度，且未發(fā)生極大錯(cuò)誤、大錯(cuò)誤和小錯(cuò)誤。

本研究存在6株（12.0%，6/50）MRCNS菌株對(duì)替考拉寧耐藥，包括5株溶血葡萄球菌和1株表皮葡萄球菌。類(lèi)似的結(jié)果也出現(xiàn)在日本Nakamura等[7]對(duì)1992－2001年血培養(yǎng)分離出的凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)多種抗真菌藥物敏感性的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)10.3%（61株）的凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)替考拉寧不敏感，包括56株表皮葡萄球菌、1株頭狀葡萄球菌和1株溶血葡萄球菌。這也提示我們應(yīng)該對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌逐漸產(chǎn)生替考拉寧的耐藥現(xiàn)象給予必要的關(guān)注。此外，本研究中對(duì)替考拉寧耐藥的VRE菌株均攜帶vanA基因，VanA 型VRE的 VanS蛋白的組氨酸激酶活性可被萬(wàn)古霉素及替考拉寧激活，VanA 型VRE對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧均耐藥[8]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素和達(dá)托霉素不敏感的菌株，替加環(huán)素和達(dá)托霉素對(duì)于多重耐藥革蘭陽(yáng)性菌具有很好的抗菌活性。多重耐藥革蘭陽(yáng)性菌對(duì)左氧氟沙星的敏感性很差，臨床上使用該藥物治療多重耐藥革蘭陽(yáng)性菌感染時(shí)應(yīng)當(dāng)予以注意。

總之，國(guó)產(chǎn)利奈唑胺對(duì)多重耐藥葡萄球菌及腸球菌具有極強(qiáng)的體外抗菌活性，且與進(jìn)口利奈唑胺的體外抗菌活性高度一致。