成團(tuán)泛菌苯丙氨酸氨基變位酶的熱穩(wěn)定性改造

劉輝，張葦苗，徐建，周麗*，周哲敏*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

來源于成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)的苯丙氨酸氨基變位酶(phenylalanine aminomutase,PaPAM)可催化α-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為(S)-β-苯丙氨酸[1-2]，(S)-β-苯丙氨酸是合成抗生素andrimid[2]的重要組成物質(zhì)之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而野生型的PaPAM熱穩(wěn)定性較差，酶活也較低，尤其是當(dāng)溫度超過50 ℃,酶活力顯著下降，處理1 h后剩余酶活只有30%左右，酶活低也是限制其生產(chǎn)應(yīng)用的一個(gè)障礙，因此現(xiàn)階段還不能滿足大規(guī)模加工工藝需求，其工業(yè)應(yīng)用受到限制[3-4]。

苯丙氨酸氨基變位酶(phenylalanine aminomutase，PAM，EC: 5.4.3.10)是MIO(4-methylideneimidazole-5-one)家族酶成員之一，MIO是一種新的內(nèi)源性輔因子，經(jīng)過翻譯后修飾系統(tǒng)將氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)轉(zhuǎn)化而成的[5-6]。目前認(rèn)為MIO依賴性酶的轉(zhuǎn)氨機(jī)制是Friedel-Crafts[7-9]，經(jīng)兩步反應(yīng)：第一步反應(yīng)，MIO進(jìn)攻底物的苯環(huán)，使苯環(huán)瞬間喪失芳香性，形成帶正電荷的中間體，活化α位的質(zhì)子，苯丙氨酸脫去氨基，形成不飽和酸(反式肉桂酸)，MIO形成MIO-NH2中間復(fù)合物；第二步反應(yīng)，中間復(fù)合物氨基和氫質(zhì)子交給反式肉桂酸的不飽和雙鍵的β位，形成β-苯丙氨酸，完成催化過程。因此，如果反應(yīng)在催化完第一步后就結(jié)束了，體現(xiàn)的是苯丙氨酸裂解酶活性；如果完成這兩步催化反應(yīng)，則體現(xiàn)的是苯丙氨酸氨基變位酶活性。在MIO依賴型酶中，酶活中心上方覆蓋的loop環(huán)的柔性大小對(duì)酶學(xué)性質(zhì)起著重要的作用[10]。例如，BARTSCH等[11]將T.chinensis來源的PAM(TcPAM)酶活中心上覆蓋的loop環(huán)柔性增大，loop的靈活性提高，酶活中心構(gòu)象不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致肉桂酸中間體從酶活中心釋放出來，增大了loop環(huán)的柔性，成功將氨基變位酶的活性變成氨基裂解酶的活性。反之，降低這些loop環(huán)的柔性、提高其穩(wěn)定性，反應(yīng)產(chǎn)生的中間體就不易從酶活中心釋放出去，有利于上述兩步反應(yīng)中的第二步反應(yīng)進(jìn)行[12]，有利于提高苯丙氨酸氨基變位酶的活性以及熱穩(wěn)定性。同時(shí)，催化產(chǎn)生(R)-β-苯丙氨酸的TcPAM，其酶活以及熱穩(wěn)定性都優(yōu)于PaPAM，所以將PaPAM的氨基酸序列突變?yōu)門cPAM上的相應(yīng)氨基酸，有望改進(jìn)PaPAM的催化性質(zhì)。

此外，多項(xiàng)研究表明[13-14]，定點(diǎn)突變改造酶分子氨基酸組成，可有效提高酶的熱穩(wěn)定性。WU[15]將T.chinensis來源PAM的319 位帶負(fù)電荷的谷氨酸突變成不帶電荷的甲硫氨酸，獲得突變酶PaPAM-Q319M，酶的區(qū)域選擇性發(fā)生改變，氨基偏向添加在底物不飽和雙鍵的β位。NAIK等[16]發(fā)現(xiàn)以下的氨基酸置換可能改變酶的熱穩(wěn)定性，比如帶正電荷極性氨基酸之間的置換(賴氨酸Lys置換精氨酸Arg)、極性氨基酸置換非極性氨基酸(絲氨酸Ser置換丙氨酸Ala)以及極性氨基酸之間的置換(甘氨酸Gly置換丙氨酸Ala)。在酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)中，酶分子表面的丙氨酸與甘氨酸互換可導(dǎo)致疏水作用的增加，進(jìn)而有可能導(dǎo)致酶分子穩(wěn)定性的提高。另一種情況下，KHURANA[17]將酶分子表面的疏水氨基酸變?yōu)橛H水氨基酸，提高了脂肪酶的穩(wěn)定性。JAOUADI[14]通過優(yōu)化絲氨酸蛋白酶表面電荷與電荷之間的相互作用提高了其熱穩(wěn)定性。

本文嘗試改變P.agglomerans來源PAM酶活中心上方loop環(huán)上的氨基酸及與其相互作用位點(diǎn)氨基酸，分別突變?yōu)椴煌愋偷陌被?，降低loop環(huán)的柔性，以期穩(wěn)定酶活中心的結(jié)構(gòu)，提高酶的熱穩(wěn)定性及酶活。本研究為苯丙氨酸氨基變位酶的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒以及培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室保藏的EscherichiacoliJM109以及E.coliBL21(DE3)菌株分別用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建和基因表達(dá)?；瘜W(xué)合成P.agglomerans來源的苯丙氨酸氨基變位酶的基因序列，并克隆到表達(dá)載體pET-28a的限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Hind III之間，得到重組質(zhì)粒pET-28a-PAM。

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10,加入抗生素(卡那霉素)的質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.2 材料與儀器

α-苯丙氨酸、β-苯丙氨酸，Sigma公司；蛋白純化鎳柱、蛋白純化儀器，AKTA公司；高效液相色譜，日立公司;PCR儀器，BIO-RAD公司;多功能酶標(biāo)儀，Bioteck公司;pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因操作

以質(zhì)粒pET-28a-PAM為模板，采用定點(diǎn)突變(重疊延伸)方法突變野生PaPAM基因。相關(guān)引物如表1所示。PCR得到的基因產(chǎn)物用DpnI酶消化以降解質(zhì)粒模板，然后轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中。重組質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化至E.coliBL 21(DE3)中構(gòu)建PAM突變體表達(dá)菌株。

1.3.2PaPAM酶的表達(dá)

挑取重組菌株單菌落接種于含5 mL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。將上述種子液培養(yǎng)物按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種于含卡那霉素質(zhì)量濃度50 μg/mL的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16～20 h。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

1.3.3 重組蛋白的純化和鑒定

離心收集培養(yǎng)后的重組菌體，按濃縮5倍體積比例重懸于蛋白結(jié)合緩沖溶液(50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)，超聲破碎細(xì)胞，12000 r/min離心50 min，上清用0.22 μm濾膜過濾，獲得粗酶液。用10 倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液平衡5 mL的His Trap HF柱，取20 mL破碎上清液上樣，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白質(zhì)，用8倍柱體積的500 mmol/L咪唑緩沖液線性洗脫蛋白質(zhì)，收集樣品后用透析袋密封，置于1/15 mol/L Na2HPO4和KH2PO4緩沖液(pH 8.5) 中4 ℃透析過夜，去除殘余咪唑，獲得純酶。用SDS-PAGE方法[18]分析鑒定粗酶液和純化后蛋白的純度。

1.3.4 蛋白濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用常規(guī)的Bradford法[19]測(cè)定。

1.3.5 酶活的測(cè)定

野生型酶和突變體純酶在使用前調(diào)成相同的蛋白濃度。在1/15 mol/L Na2HPO4和KH2PO4緩沖液(pH 8.5)中加入200 μL 20 mmol/L α-苯丙氨酸為底物、再加入100 μg純酶，反應(yīng)終體積為0.5 mL，50 ℃下反應(yīng)30 min，100 ℃滅活20 min。酶活力單位定義為：在50 ℃、pH 8.5、底物終濃度為8 mmol/L時(shí)，30 min內(nèi)將1 μmol α-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為1 μmol β-苯丙氨酸所需的酶量。

1.3.6 最適溫度的測(cè)定

分別在30、40、50、60、70 ℃下測(cè)定酶的活性，將最高的酶活力定義為100%，繪制得相對(duì)酶活隨溫度變化曲線。

1.3.7 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在50 ℃分別保溫30、60、90、120 min，以及在60 ℃條件下分別保溫10、20、30 min，測(cè)定殘留酶活性。定義保溫0 min所測(cè)得的酶活為100%，繪制得相對(duì)殘留酶活隨溫度變化曲線。

1.3.8 最適pH值的測(cè)定

在不同pH值的緩沖液中測(cè)定野生型酶和突變體酶的活性，定義最高酶活力值為100%，繪制得相對(duì)酶活隨pH值變化曲線。其中pH 7.0～9.0緩沖液為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 9.0～11.0緩沖液為50 mmol/L Na2CO3緩沖液。

1.3.9 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

以濃度范圍為1～20 mmol/L α-苯丙氨酸為底物，在50℃下反應(yīng)30 min，測(cè)量β-苯丙氨酸的生成反應(yīng)速率，通過軟件GraphPad Prism 5擬合得到Km與Vmax值，然后再根據(jù)Kcat=Vmax/ [Enzyme]求得Kcat及催化效率常數(shù)Kcat/Km。

1.3.10 底物和產(chǎn)物的測(cè)定

底物反應(yīng)后經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，用高效液相色譜檢測(cè)。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)(波長(zhǎng)為210 nm)，色譜柱為Diamonsil 5 μm C18(2)250 mm×4.6 mm，流動(dòng)相為V(0.1%甲酸溶液)∶V(乙腈)=9∶1，檢測(cè)時(shí)間為25 min，柱溫為40 ℃，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)的選擇

對(duì)不同來源PAM一級(jí)序列進(jìn)行比對(duì)，獲得了PaPAM的非保守氨基酸位點(diǎn)(圖1)。

T.chinensis來源PAM的78位、92位、93位氨基酸對(duì)酶活中心上方loop環(huán)的柔性影響較大[11]，本研究將P.agglomerans來源PAM的三級(jí)晶體結(jié)構(gòu)與其進(jìn)行比對(duì)(圖2)，發(fā)現(xiàn)2種來源酶的酶活中心結(jié)構(gòu)高度相似，PaPAM上對(duì)應(yīng)位點(diǎn)分別為76位、90位、91位(圖3-a)，且都為非保守位點(diǎn)。此外，選取PaPAM酶活中心上方其他loop環(huán)、且非保守位點(diǎn)73位、95位、439位、462位和455位進(jìn)行突變(圖3-b)。上述位點(diǎn)分別突變?yōu)椴煌愋偷陌被幔ㄖ行苑菢O性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、帶正電荷極性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)和中性極性氨基酸(天冬酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸)、帶負(fù)電荷極性氨基酸(谷氨酸)。突變點(diǎn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)中分布如圖3所示。

a-P. agglomerans;b-T. chinensis;c-底物圖2 P.agglomerans與T.chinensis來源的PAM三級(jí)晶體結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.2 Third order crystal structure comparison of P.agglomerans and T. chinensis

a-對(duì)比結(jié)果位置;b-loop兩端位置圖3 突變位點(diǎn)在苯丙氨酸氨基變位酶三維結(jié)構(gòu)中的分布Fig.3 The distribution of mutants in PAM three-dimensional structure注：數(shù)字所示為突變位點(diǎn)

2.2 單點(diǎn)突變的結(jié)果初步篩選

突變體純酶液分別測(cè)定酶活，結(jié)果如圖4-a所示。所有突變點(diǎn)中，A95R、I91M突變體的酶活比原酶有顯著提高。439位的丙氨酸、455位苯丙氨酸和462位的甘氨酸距離酶活中心較近，經(jīng)過突變后酶分子失活。

突變體純酶液于50 ℃處理60 min后，測(cè)定剩余酶活，以分析其熱穩(wěn)定性。如圖4-b所示，野生型PaPAM經(jīng)過處理后僅剩余30%酶活，而多個(gè)突變體熱穩(wěn)定性明顯提高，其中，突變體I91M、A95R的熱穩(wěn)定性明顯提高，剩余酶活分別達(dá)到了83%、43%。如圖4-c所示，60 ℃處理20 min后，野生型PaPAM經(jīng)過處理后僅剩余40%酶活，而多個(gè)突變體熱穩(wěn)定性明顯提高，其中，突變體I91M剩余酶活達(dá)到了88%。

a-酶活篩選；b-50 ℃穩(wěn)定性篩選; c-60 ℃穩(wěn)定性篩選圖4 突變體初步篩選結(jié)果Fig.4 Preliminary screening of single mutants

突變體I91M, A95R熱穩(wěn)定性提高，可能是由于穩(wěn)定了酶活中心所覆蓋的loop穩(wěn)定性，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定。因此，文本選擇酶活提高的A95R和熱穩(wěn)定性顯著提高的I91M突變體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 突變體酶學(xué)性質(zhì)表征

將野生型PaPAM以及突變體I91M、A95R進(jìn)行酶學(xué)表征。如圖5-a所示，野生型PaPAM和A95R突變體的最適溫度為50 ℃，而突變體I91M的最適反應(yīng)溫度提高到55 ℃；如圖5-b，突變體的最適pH并未發(fā)生偏移。

a-最適溫度曲線；b-最適pH曲線圖5 最適反應(yīng)條件的測(cè)定Fig.5 Determination of the optimum reaction conditions

如圖6所示，2個(gè)突變體的熱穩(wěn)定性明顯提高，其中I91M在50 ℃保溫60 min可殘留83%酶活，而野生型PaPAM僅殘余30%酶活。I91M突變體在50 ℃下的半衰期提高為107.59 min(表2)，比野生型酶PaPAM(50 ℃下的半衰期僅為26 min)提高了4倍。

2.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

為了研究催化活性，測(cè)定了突變體酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)(如表3)。2種突變體Km值均大于野生型PaPAM，說明與底物的親和能力減弱，可能原因是酶活中心的氨基酸突變影響了酶活中心與底物結(jié)合的周圍環(huán)境所致。然而，突變體的Kcat均比野生型PaPAM提高了2倍以上，可能原因是穩(wěn)定的酶活中心構(gòu)象更有利于氨基變位的第二步反應(yīng)進(jìn)行[11]。

圖6 熱穩(wěn)定性的測(cè)定原始酶與突變體的熱穩(wěn)定性(在50 ℃下殘余酶活隨時(shí)間變化)Fig.6 Determination of the thermal stability of wild-type PAM and mutants were determined by monitoring residual activities over time (0 to 120 min) at 50 ℃

酶半衰期/minPaPAM26.65±0.59I91M107.59±0.88A95R46.65±0.14

表3 野生型酶與突變體酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及比酶活Table 3 Kinetic parameters and specific activities of wild-type PAM and mutants

另外，I91M的穩(wěn)定性提高較多，但是Kcat值卻不如A95R突變體高，原因可能是突變后的甲硫氨酸與底物氨基酸的苯環(huán)形成穩(wěn)定的S/Π作用導(dǎo)致穩(wěn)定性增加[12]，酶活不高的原因可能是甲硫氨酸的硫原子同時(shí)參與形成配位鍵，增強(qiáng)了底物羧酸鹽結(jié)合口袋[15]，不利于底物與酶活中心附近氨基酸的質(zhì)子傳遞。

3 討論

本文通過基因定點(diǎn)突變構(gòu)建重組的苯丙氨酸氨基變位酶突變體，通過篩選得到催化活性和熱穩(wěn)定性都顯著提高的突變體I91M、A95R。其中I91M的熱穩(wěn)定性提高明顯，50 ℃保溫1 h，剩余酶活由野生型酶的30%左右提高至83%左右，并且其酶活比原始酶略有提高。

目前，在MIO依賴型酶中，催化因子Tyr所在的柔性區(qū)Tyr-loop對(duì)酶學(xué)性質(zhì)起著相當(dāng)重要的作用[10]。張帆[20]通過改變loop的柔性成功使苯丙氨酸氨基裂解酶的最適pH發(fā)生偏移，更適應(yīng)酸性環(huán)境，并對(duì)治療苯丙酮尿癥(phenylketonurics, PKU)具有實(shí)際應(yīng)用。

本文探究苯丙氨酸氨基變位酶催化中心上所覆蓋的2個(gè)柔性loop環(huán)的穩(wěn)定性對(duì)酶性質(zhì)的作用，通過篩選loop環(huán)上的突變體，改善了酶的穩(wěn)定性。該方法可作為一種改善酶穩(wěn)定性的有效策略，為其他酶的改造提供參考。相信基于對(duì)蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，在未來可以解析更多的蛋白酶催化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多的應(yīng)用。