褐色嗜熱裂孢菌脫色過氧化物酶的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化

朱竹兵，孫亞武，唐蕾,*

1 (工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2 (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

染料脫色過氧化物酶(DyPs)是一類具有降解多種染料能力的酶類，首次發(fā)現(xiàn)于真菌ThanatephoruscucumerisDec 1中[1]，屬于胞內(nèi)蛋白[2]。1999年，研究者將其分離純化，分析其特征發(fā)現(xiàn)，在407 nm處有1個Soret吸收峰，以及它的Na2S2O4還原形式在556 nm有1個吸收峰，表明血紅素組分的存在[3]。深入研究發(fā)現(xiàn)， DyPs是血紅素過氧化物酶家族中區(qū)別于傳統(tǒng)血紅素過氧化物酶的新型家族，例如，DyPs在二級結(jié)構(gòu)上具有多個α-螺旋和β折疊，其他類型血紅素過氧化物酶缺少β折疊[4]；DyPs有特定結(jié)構(gòu)Fe-His-Asp，而血紅素過氧化物酶有Fe-His-His三聯(lián)體的保守氨基酸[5-7]。

DyPs的特點是利用過氧化氫作為電子受體催化各種有機(jī)物，包括蒽醌染料[8]、酚類底物、藜蘆醇[9]、愈創(chuàng)木酚[10]、木質(zhì)素及木質(zhì)素模型化合物[11]，尤其對蒽醌類染料活性最高，因而具有潛在的應(yīng)用價值，可以實現(xiàn)生物法對染料污水的徹底降解，從而避免化學(xué)、物理等方法降解的2次污染問題。目前，人們主要從脫色過氧化物酶的底物特異性、多樣性、晶體結(jié)構(gòu)、分類、定點突變、催化機(jī)理等[5,12-15]方面展開研究，不僅提高了DyPs的穩(wěn)定性和表達(dá)效率，而且實現(xiàn)了脫色過氧化物酶對底物的有效催化。但是在細(xì)菌中異源表達(dá)DyPs時，重組蛋白的含量偏低,一般在10 mg/L以下。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TfuDyP與修飾蛋白(SUMO)[16]融合表達(dá)，大腸桿菌中重組蛋白量可增至約200 mg/L，然而高度過表達(dá)的SUMO-TfuDyP幾乎沒有活性。通過紫外-可見吸收光譜法和高分辨率質(zhì)譜法對酶的分析表明大部分高度過表達(dá)的酶只包含有鐵缺乏的血紅素前體原卟啉IX(PPIX)而不是血紅素[17]。血紅素作為脫色過氧化物酶的輔基，其胞內(nèi)合成量對DyPs催化活性起著至關(guān)重要的作用，如何在提高DyPs表達(dá)量的同時，提高其輔基血紅素的含量尚待深入研究。

本文以來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)的TfuDyP為研究對象。以pET28a(+)為載體，在大腸桿菌中異源表達(dá)TfuDyP。一方面通過誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度優(yōu)化，獲得重組蛋白TfuDyP最佳表達(dá)條件。另一方面研究了外源添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度影響，以期更好地提高輔基血紅素合成，從而提高目的蛋白的催化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

宿主菌E.coliBL21由實驗室保藏，含有目的基因的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)購于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

1.1.3 主要試劑

SuperBradford蛋白定量試劑盒,康為世紀(jì)生物科技有限公司;活性藍(lán)19,上海一基實業(yè)有限公司;菌株構(gòu)建所用的質(zhì)粒提取試劑盒,購自TaKaRa(大連); 5-氨基乙酰丙酸,購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī),日本日立公司; SM-5600細(xì)胞超聲破碎儀,美國cole-parmer; AKTA AVANT25,美國GE公司; Enspire酶標(biāo)儀,美國珀金埃爾默有限公司;紫外可見分光光計,日本日立株式會社。

1.2 方法

1.2.1 TfuDyP在大腸桿菌中的構(gòu)建

利用National Center for Biotechnology Information (NCBI)數(shù)據(jù)庫獲得TfuDyP(accession number Q47KB1)全長核酸序列，合成目的基因，以已購的質(zhì)粒pET-28a(+)為載體，將含有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21進(jìn)行異源表達(dá)，重組質(zhì)粒如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a(+)-TfuDyP示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmid pET28a(+)-TfuDyP

1.2.2 重組TfuDyP分離純化

將重組菌株接種到含有100 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)12 h，以4%(V/V)接種量轉(zhuǎn)接至含有100 mL新鮮培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，相同條件培養(yǎng)至菌體OD600達(dá)到0.6～0.8時。向培養(yǎng)基中添加終濃度為0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，30 ℃誘導(dǎo)12 h，8 000 r/min離心20 min得到菌體，用 50 mmol/L的pH 7.4磷酸鉀緩沖溶液重新懸浮細(xì)胞，超聲破碎30 min，10 000 r/min離心30 min收集上清液，過0.22 μm水系濾膜得到粗酶液，通過1 mL His TrapTMHP親和鎳柱分離純化，收集目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳以鑒定重組TfuDyP純度。

1.2.3 酶活力及蛋白濃度的測定

向反應(yīng)體系中依次加入100 mmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)，100 μmol/L活性藍(lán)19和適量的酶液，最后加入終濃度為0.1 mmol/L過氧化氫啟動反應(yīng)，酶促反應(yīng)10 min，然后通過加入200 μL 2% SDS終止反應(yīng)。在室溫下，于波長595 nm處檢測吸光值變化[17]。蛋白質(zhì)濃度測定采用BCA法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

TfuDyP酶活定義：在25 ℃，pH 4.5條件下，每分鐘氧化1 μmol活性藍(lán)19所需的酶量為1 U。比酶活測定如式(1):

(1)

式中：比酶活單位U/mg;酶活單位U/mL;蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.2.4 重組TfuDyP的表達(dá)條件優(yōu)化

表達(dá)條件優(yōu)化：向培養(yǎng)基中添加終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)時間為8、10、12、14、16 h，誘導(dǎo)溫度為16、23、30、37 ℃，8 000 r/min離心20 min得到菌體，用 50 mmol/L的pH 7.4磷酸緩沖溶液重新懸浮細(xì)胞，超聲破碎30 min，10 000 r/min離心30 min收集上清液，分離純化，測定蛋白濃度，計算比酶活。

1.2.5 外源添加物對重組TfuDyP表達(dá)的影響

1.2.5.1 氨基酸與金屬離子對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響

向培養(yǎng)基中分別添加終濃度為100 μmol/L的組氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、FeCl2、CoCl2以及MnCl2；分別添加終濃度為0、40、60、80、100、120 μmol/L的FeCl2；在最佳表達(dá)條件下培養(yǎng)、收集菌體、破碎、離心、收集上清液過0.22 μm水系濾膜得到粗酶液，測定菌體生長量和計算酶活。

1.2.5.2 氯高鐵血紅素和5-氨基乙酰丙酸濃度對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響

向培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0、12、16、20、24 μmol/L的氯高鐵血紅素；分別添加終濃度為0、100、150、200、300、400、500 μmol/L的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)。在最佳表達(dá)條件下培養(yǎng)，測定菌體生長量和計算酶活。

1.2.6 外源添加物對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響

分別將100 μmol/L的5-ALA、氨基酸(Glu)、金屬離子(Fe2+、Mn2+、Co2+)、氨基酸與鐵組合(Glu+Fe2+)加入培養(yǎng)基中，最佳表達(dá)條件下培養(yǎng)，收集菌體離心、懸浮、破碎、離心，收集上清液過0.22 μm水系濾膜得到粗酶液，通過1 mL His TrapTMHP親和鎳柱分離純化，用10個柱體積的洗脫緩沖液進(jìn)行線性洗脫，對目的蛋白進(jìn)行全波長掃描和比酶活的計算。

血紅素飽和度定義為在408 nm處的吸光值與280 nm處之比，即A408/A280。

2 結(jié)果與分析

2.1 TfuDyP在大腸桿菌中的異源表達(dá)

2.1.1 TfuDyP的表達(dá)與純化

將含有全長1 293 bp的目的基因的pET28a(+)-TfuDyP和空載pET28a(+)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中進(jìn)行異源表達(dá)。收集菌體、破碎、離心、分離純化，將粗酶液和純化后蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳確定目的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖2，有明顯的目的蛋白條帶，分子質(zhì)量約為46 kDa，與理論計算值一致。將目標(biāo)條帶割膠回收，進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析[18]，檢測數(shù)據(jù)庫為SwissProt 201704 (554241 sequences; 198410167 residues)，與庫中理論質(zhì)量為45 957 Da的dye-decolorizing peroxidase Tfu_3078 OS=Thermobifidafusca匹配，匹配分?jǐn)?shù)為432(表1)，確定重組TfuDyP在E.coliBL21成功表達(dá)。

1-純化的TfuDyP；2-Marker；3-空載pET-28a；4-不加IPTG誘導(dǎo)劑；5-IPTG誘導(dǎo)表達(dá)圖2 重組蛋白TfuDyP表達(dá)SDS-PAGE電泳分析圖Fig.2 The SDS-PAGE electrophoresis for recombinant TfuDyP expression

表1 重組蛋白TfuDyP的飛行時間質(zhì)譜分析Table 1 Time-of-flight mass spectrometry analysis of recombinant TfuDyP

注：DYP THEFY; MASS:45957; Score:432; Matches:6(5); Sequences:6(6) Dye-decolorizing peroxidase Tfu_3078 OS=Thermobifidafusca(strain YX) GN=Tfu_3078 PE=1 SV=1。

2.1.2 重組TfuDyP誘導(dǎo)條件優(yōu)化

在新生肽鏈的聚集速率高于蛋白折疊速率的情況下，容易出現(xiàn)不可溶性蛋白。因此，如何降低重組蛋白合成的速率就顯得尤為關(guān)鍵，通常采用的方法為降低培養(yǎng)溫度和使用低濃度的誘導(dǎo)劑。低溫下重組蛋白的合成速率降低，新合成的蛋白就擁有更多的時間進(jìn)行折疊。此外，降低培養(yǎng)溫度也可以減少重組蛋白被宿主降解的量，提升重組蛋白的穩(wěn)定性[19]。因此，本實驗對影響酶表達(dá)水平的關(guān)鍵因素即誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了研究。

結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.3 mmol/L時，重組TfuDyP的比酶活達(dá)到最大值21.3 U/g，隨著誘導(dǎo)劑濃度增加，比酶活緩慢下降(圖3-a)。在誘導(dǎo)時間為14 h時，比酶活達(dá)到最高值24 U/g，而在低于14 h的情況下，比酶活隨著誘導(dǎo)時間的增加明顯升高，誘導(dǎo)時間高于14 h時，比酶活反而下降(圖3-b)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時，比酶活最高值27.9 U/g，接近16 ℃時的2倍，可以看出溫度對酶活影響較大(圖3-c)。溫度較低(16 ℃)時，菌體的繁殖受阻，活性蛋白合成量低，酶活較低。溫度過高(37 ℃)，重組TfuDyP的表達(dá)水平提高，但是高溫時重組TfuDyP的合成速率高于蛋白的折疊速率，容易形成不可溶性蛋白，導(dǎo)致酶活降低。綜上所述最佳表達(dá)條件為IPTG濃度0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時間14 h，誘導(dǎo)溫度30 ℃。

圖3 重組蛋白TfuDyP表達(dá)條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of expression conditions of recombinant TfuDyP

2.2 外源添加物對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響

DyPs是血紅素過氧化物酶家族中的一種，重組TfuDyP必須與輔基血紅素結(jié)合，才能實現(xiàn)對底物的催化活性。環(huán)境因素對重組TfuDyP表達(dá)和血紅素合成起著關(guān)鍵作用，例如，F(xiàn)e2+、血紅素前體 5-ALA以及氯高鐵血紅素通常作為添加物以促進(jìn)血紅素合成[20-22]；谷氨酸參與TfuDyP的組成和提供血紅素合成的前體[23]；Mn2+是代謝途徑中許多酶類的激活劑。本實驗選取幾種外源添加劑(Glu、His、Fe2+、Mn2+、Co2+、氯高鐵血紅素、5-ALA)，在上述最佳表達(dá)條件下，研究其對重組TfuDyP酶活的影響。

2.2.1 氨基酸與金屬離子對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響

向培養(yǎng)基中分別添加終濃度為100 μmol/L的His、Glu以及FeCl2、CoCl2、MnCl2，其中不添加任何添加劑為對照組，考察氨基酸和金屬離子對重組TfuDyP酶活和菌體生長的影響。結(jié)果如圖4-a所示，CoCl2對重組TfuDyP酶活有一定抑制作用，添加His對重組TfuDyP酶活和菌體的生長基本保持不變，外源添加FeCl2、MnCl2和Glu都能提高重組TfuDyP酶活和菌體生長量。從中可以看出FeCl2對酶活影響最明顯，因此，進(jìn)一步探究了FeCl2濃度對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響。結(jié)果表明隨著FeCl2濃度增加，酶活和菌體量呈現(xiàn)增長趨勢，提高濃度為80 μmol/L時，酶活達(dá)到最大值31.31 U/L，較空白對照提高近67.6%(圖4-b)。然而當(dāng)Fe2+濃度高于60 μmol/L，菌體量逐漸下降。

圖4 金屬離子和氨基酸對重組TfuDyP酶活和菌體生長影響Fig.4 Effect of metal ions and amino acids on recombinant TfuDyP activity and cell growth

2.2.2 氯高鐵血紅素和5-ALA濃度對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響

實驗結(jié)果顯示，當(dāng)氯高鐵血紅素濃度達(dá)到16 μmol/L和18 μmol/L時，重組TfuDyP酶活和菌體濕重分別達(dá)到最大值44.95 U/L和6.05 g/L，低濃度的氯高鐵血紅素對重組TfuDyP酶活和菌體量具有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)氯高鐵血紅素濃度大于18 μmol/L時，對菌體生長有明顯的抑制作用(圖5-a)。

圖5-b為5-ALA濃度對重組TfuDyP酶活和菌體生長的影響。當(dāng)外源添加的5-ALA濃度低于400 μmol/L時，酶活與其添加量呈現(xiàn)出高度線性正相關(guān)，當(dāng)濃度為400 μmol/L酶活達(dá)到最大值65 U/L，大約是對照組的3倍。當(dāng)5-ALA濃度達(dá)低于200 μmol/L時，菌體量與5-ALA濃度呈線性增長。

本實驗在最佳表達(dá)條件下，研究了添加劑種類和濃度對重組TfuDyP表達(dá)及酶活性的影響。適量濃度的Glu、Fe2+、Mn2+、氯高鐵血紅素和5-ALA，一方面提高了菌體生長量，另一方面促進(jìn)了重組TfuDyP催化活性。而鈷離子抑制了重組TfuDyP酶活。實驗結(jié)果表明，添加劑對重組TfuDyP酶活性影響存在差異：5-ALA>氯高鐵血紅素> Fe2+> Glu > Mn2+>對照組> Co2+。

圖5 氯高鐵血紅素和5-ALA對重組TfuDyP酶活和菌體生長影響Fig.5 Effect of hemin and 5-ALA on recombinant TfuDyP activity and cell growth

2.3 外源添加物對重組TfuDyP中血紅素飽和度和酶活性的影響

從2.2研究結(jié)果中可以看出，5-ALA等外源添加劑對重組TfuDyP催化活性產(chǎn)生一定影響，為了探究外源添加劑對重組TfuDyP酶活的影響與血紅素的關(guān)系，向培養(yǎng)基中分別添加終濃度為100 μmol/L的5-ALA、Glu、Fe2+、Mn2+、Co2+、Fe2++ Glu，其中不添加任何添加劑為對照組，在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，對純化目的蛋白進(jìn)行全波長掃描。

2.3.1 外源添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響

波長408 nm為血紅素的特征吸收，全波長掃描顯示添加了5-ALA、Fe2+、Glu、Mn2+、Co2+的408 nm處的吸收值分別為1.378、0.89、0.741、0.579、0.51(圖6)。結(jié)果表明，除了Co2+，添加劑(5-ALA、Fe2+、Glu、Mn2+)明顯高于對照組。

添加Glu + Fe2+、Fe2+、Glu和對照組在波長408 nm處的吸收值分別為1.027、0.89、0.741、0.579(圖7)，表明氨基酸與Fe2+的組合可進(jìn)一步提高重組TfuDyP中血紅素的含量。

圖6 添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響Fig.6 Effect of different amino acids on heme saturation in recombinant TfuDyP

綜上所述，重組TfuDyP在波長408 nm處的吸收值：5-ALA>Fe2+>Glu>Mn2+>對照組>Co2+，與添加劑對重組TfuDyP酶活的影響結(jié)果是一致的。氨基酸與Fe2+的組合能夠進(jìn)一步促進(jìn)血紅素合成，但遠(yuǎn)不及5-ALA的添加，氨基酸與Fe2+的添加不是簡單的疊加效應(yīng)，對血紅素合成可能是復(fù)雜的協(xié)同作用。

2.3.2 重組TfuDyP中血紅素飽和度和酶活的關(guān)系

為了探究重組TfuDyP酶活和血紅素飽和度兩者之間的關(guān)系，將各種添加劑以終濃度為100 μmol/L添加到培養(yǎng)基中，在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，對純化的目的蛋白進(jìn)行全波長掃描和比酶活的計算。

圖7 鐵離子和氨基酸對重組TfuDyP中的血紅素飽和度的影響Fig.7 Effect of iron ions and amino acids on heme saturation in recombinant TfuDyP

實驗結(jié)果表明，Glu、5-ALA、Fe2+、Glu +Fe2+能夠提高重組TfuDyP中血紅素飽和度，Co2+對Heme飽和度具有抑制作用(表2)。選取幾種外源添加劑(Co2+、Glu+Fe2+、5-ALA)，考察重組TfuDyP中血紅素飽和度與比酶活關(guān)系。實驗結(jié)果顯示，添加劑對重組TfuDyP中血紅素飽和度的影響和比酶活的影響呈正相關(guān)性(圖8)。

表2 不同外源添加劑對重組TfuDyP中Heme飽和度的影響Table 2 Effect of different exogenous additives on heme saturation in recombinant TfuDyP

注：B-不加任何添加劑的對照組；其他外源添加劑最終濃度0.1 mmol/L。

圖8 添加劑對酶活與heme飽和度影響關(guān)系圖Fig.8 Effect of different additives on enzyme activity and heme saturation

血紅素輔基摻入脫輔基重組蛋白被認(rèn)為對于全蛋白的可溶性和活性至關(guān)重要，提高血紅素及其前體物質(zhì)5-ALA的水平是目前使用的最主要策略[24]，KERY等[25]發(fā)現(xiàn)5-ALA的添加提高了在大腸桿菌中表達(dá)的人源胱硫醚β-合成酶的血紅素飽和度和產(chǎn)率，與本文一致；但是也有報道指出，5-ALA的添加對目標(biāo)重組血紅素過氧化物酶的活性沒有顯著影響[19,28]，與本研究的結(jié)果不同。而Co2+、Glu+Fe2+對血紅素飽和度及TfuDyP的比酶活關(guān)系的影響未見報道。

3 結(jié)論

脫色過氧化物酶是血紅素過氧化物酶家族中的新家族，以血紅素為輔基，過氧化氫為電子受體，催化各種有機(jī)物。本課題以來源于T.fusca的DyP型過氧化物酶(TfuDyP)為研究對象，以pET28a(+)為載體，在大腸桿菌中異源表達(dá)脫色過氧化物酶TfuDyP，一方面優(yōu)化重組TfuDyP表達(dá)條件(誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度)，另一方面研究了添加劑對重組TfuDyP酶活和血紅素飽和度影響，得出如下結(jié)論：

誘導(dǎo)劑濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時間為14 h，誘導(dǎo)溫度30 ℃，胞內(nèi)比酶活達(dá)到27.9 U/g，是重組蛋白TfuDyP最佳表達(dá)條件。優(yōu)化培養(yǎng)基成分，發(fā)現(xiàn)氯高鐵血紅素、5-ALA、Glu、Fe2+、Mn2+能提高重組TfuDyP催化活性，尤其是氯高鐵血紅素、5-ALA、Fe2+。在研究外源添加劑對血紅素飽和度影響過程中發(fā)現(xiàn)，在血紅素最大吸收波長408 nm處的吸收值：5-ALA>Glu + Fe2+>Fe2+>Glu>Mn2+>對照組>Co2+，與添加劑(5-ALA、氯高鐵血紅素、Glu、Fe2+、Mn2+)對重組TfuDyP酶活影響結(jié)果是一致的，即添加劑是通過影響血紅素合成來影響重組TfuDyP催化活性，添加劑對血紅素飽和度影響與對比酶活影響成正相關(guān)性。DyPs作為一種新型過氧化物酶，在染料降解等領(lǐng)域具有潛在價值，如何提高重組DyPs的活性和產(chǎn)率成為其是否能實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。通常采用的血紅素前體添加物如5-ALA價格較貴[19]，而且不總是能夠達(dá)到提高酶活的效果[13, 21]。本文通過研究外源添加物對血紅素飽和度和酶活性的關(guān)系，尋找最佳的添加劑量和廉價的添加物如谷氨酸復(fù)合鐵，可為工業(yè)發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。