QuEChERS-分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定牛乳中喹氧靈殘留

齊曉茹，蘇運(yùn)聰，李 飛*，李興佳，張耀廣，柴艷兵

（石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部乳品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050021）

隨著人們生活水平的不斷改善，消費(fèi)者越來(lái)越重視食品的營(yíng)養(yǎng)與健康，對(duì)乳制品質(zhì)量的要求也在不斷提高，乳品原料質(zhì)量與安全問(wèn)題是行業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，是乳品消費(fèi)安全的先決條件[1-3]，因此嚴(yán)把乳制品原料入口關(guān)，是當(dāng)下乳品行業(yè)控制產(chǎn)品質(zhì)量的重要任務(wù)。優(yōu)質(zhì)的原料乳能夠生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的乳產(chǎn)品，原料乳的好壞對(duì)產(chǎn)品的影響至關(guān)重要。

喹氧靈（quinoxyfen）又名快諾芬、苯氧喹啉，是美國(guó)陶氏益農(nóng)公司近年來(lái)新推出的一種喹啉類(lèi)殺真菌劑[4]。目前，喹氧靈被廣泛用于各種禾谷類(lèi)作物，葉面施藥后，藥劑可迅速滲入到植株組織中，并向頂端移動(dòng)，持效期長(zhǎng)達(dá)70 d[5]。GB 2763.1—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中百草枯等43 種農(nóng)藥最大殘留限量》[6]明確規(guī)定，生乳中喹氧靈最大殘留限量為0.01 mg/kg。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于喹氧靈檢測(cè)方法的研究還比較少，Cabras等[7]研究葡萄、葡萄酒及其加工制品中喹氧靈殘留量的檢測(cè)方法；楊方等[8]研究大豆、花椰菜、櫻桃、木耳和葡萄酒等基體中喹氧靈殘留量的檢測(cè)方法；Ferri等[9]通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究喹氧靈的光轉(zhuǎn)化途徑；Duncan等[10]通過(guò)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)制備喹氧靈分析免疫試劑。對(duì)于牛乳中喹氧靈檢測(cè)方法的研究未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

QuEChERS是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)[11-12]，具有方便、高效的優(yōu)點(diǎn)[13-15]。本研究通過(guò)對(duì)喹氧靈含量測(cè)定的幾種前處理技術(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，采用QuEChERS技術(shù)深入研究牛乳中喹氧靈的測(cè)定方法，為今后牛乳中喹氧靈檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳：市售。

喹氧靈標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.80%） 美國(guó)Sigma-Alorich公司；N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）填料、C18填料（粒度40～60 μm） 美國(guó)Sepax公司；乙腈、正己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）、硫酸鎂、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂（均為分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6850-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）儀 美國(guó)Agilent公司；RE311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Yamato公司；TGL-20M離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MTN-2800W氮吹儀天津奧特賽恩斯儀器有限公司；ENVITM-18固相萃取柱美國(guó)Supelco公司；NH2固相萃取柱 美國(guó)Sepax公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，設(shè)定進(jìn)樣體積為1 μL，對(duì)色譜柱的型號(hào)和升溫程序進(jìn)行優(yōu)化，以獲取最佳檢測(cè)效果。在優(yōu)化GC-MS條件的基礎(chǔ)上，選取質(zhì)量濃度為0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，以組分含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

1.3.2.1 提取溶劑的選擇

按照相似相溶原理，結(jié)合樣品基質(zhì)的特性，選取乙腈、乙酸乙酯作為提取劑進(jìn)行比較。量取15 mL牛乳于50 mL離心管中，分別加入2 種提取溶劑（所有提取溶劑體積均為20 mL）進(jìn)行提取，加入4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉；5 000 r/min條件下離心5 min后吸取1 mL提取液于試管中，40 ℃條件下氮吹濃縮至干，加1 mL正己烷定容，渦旋混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，檢測(cè)回收率。

1.3.2.2 凈化條件的選擇

固相萃取小柱法：量取15 mL牛乳于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈、4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉；于振蕩器上劇烈振蕩2 min，在5 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液于100 mL旋蒸瓶中，殘?jiān)?0 mL乙腈重復(fù)提取1 次；離心后，合并2 次提取液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右，待凈化；用10 mL乙腈活化ENVITM-18（或NH2）固相萃取柱后，將濃縮的提取液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，然后每次用5 mL乙腈洗滌樣品瓶，洗滌液并入固相萃取柱中，重復(fù)此操作2 次；同時(shí)收集流出液于100 mL旋蒸瓶中，用10 mL乙腈洗脫固相萃取柱，合并流出液，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干；用正己烷溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?.0 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供GC-MS儀測(cè)定[16]。

QuEChERS法：稱(chēng)取10 g牛乳于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈、4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉；于振蕩器上劇烈振蕩，在5 000 r/min條件下離心10 min，使乙腈與飽和食鹽水分層，取上清液，待凈化；將上述獲得的溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有250 mg PSA、500 mg C18和750 mg無(wú)水硫酸鎂的50 mL離心管中，于振蕩器上劇烈振蕩，在5 000 r/min條件下離心10 min，取10 mL上清液，于40 ℃水浴條件下氮吹至干，加1 mL正己烷定容，渦旋混勻后，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供GC-MS儀測(cè)定。

1.3.3 方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度評(píng)價(jià)

準(zhǔn)確度、精密度評(píng)價(jià)：選取3 個(gè)不同添加水平的牛乳樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按照所優(yōu)化的方法進(jìn)行前處理。用加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度，用多次檢測(cè)的加標(biāo)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）評(píng)價(jià)方法的精密度[17]。

靈敏度評(píng)價(jià)：用空白基質(zhì)液加標(biāo)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，通過(guò)色譜軟件分析得到該條件下的信噪比（RS/N），再由此計(jì)算出RS/N為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物含量作為方法的定量限[17]。

1.3.4 市售牛乳樣品中喹氧靈含量的檢測(cè)

按照上述優(yōu)化出的前處理方法和色譜條件，對(duì)收集自75 個(gè)不同奶牛養(yǎng)殖戶(hù)的牛乳樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為0.05，采用Origin 7.5軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)比較Agilent DB-1701、Agilent VF-1701MS與Agilent HP-5MS 3 種色譜柱的分離效果，在同一程序升溫條件下，3 種色譜柱所得到的色譜峰均峰形良好，Agilent DB-1701色譜柱所得到的色譜峰響應(yīng)值明顯低于Agilent HP-5MS色譜柱所得到的色譜峰，Agilent VF-1701MS色譜柱次之，因此最終確定色譜條件為：Agilent HP-5MS色譜柱（14%氰丙基-苯基）-甲基聚硅氧烷（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫程序：40 ℃保持1 min，然后以30 ℃/min升溫至130 ℃，再以6 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣，純度≥99.999%，流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度290 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；電子轟擊源70 eV；離子源溫度300 ℃；四極桿溫度180 ℃；GC-MS傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲8 min；選擇離子監(jiān)測(cè)模式。

圖1 喹氧靈標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 1 Chromatogram of quinoxyfen standard

圖2 喹氧靈定量離子、定性離子Fig. 2 Quantitative and qualitative ions of quinoxyfen

由圖1～2可知，在上述色譜條件下，喹氧靈保留時(shí)間為15.66 min，喹氧靈色譜峰分離效果良好，峰形尖銳而對(duì)稱(chēng)，沒(méi)有雜峰干擾。喹氧靈色譜峰面積與其質(zhì)量濃度在0.00～1.00 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，喹氧靈色譜峰面積與其質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)，線性方程為y=4×106x＋63 807，式中：x代表喹氧靈的質(zhì)量濃度，y代表峰面積，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998 7，表明線性良好。

2.2 樣品前處理方法的確定

2.2.1 提取溶劑的確定

在所選提取溶劑體積一致的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用乙酸乙酯提取時(shí)樣品乳化嚴(yán)重，無(wú)法準(zhǔn)確提取上層清液，不適合用于牛乳中喹氧靈的檢測(cè)，采用乙腈提取時(shí)回收率為（95.0±4.5）%，因此本研究采用乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的確定

比較2 種常見(jiàn)的凈化方式：固相萃取小柱法（ENVITM-18 packing：12 mL、2 000 mg；NH2柱：500 mg、3 mL）和QuEChERS法（250 mg PSA、500 mg C18和750 mg MgSO4）。按1.3.2.2節(jié)進(jìn)行處理，對(duì)牛乳中喹氧靈含量進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

表1 不同凈化方式的回收率和RSD比較結(jié)果Table 1 Recovery and RSD of different purification methods

由表1可知，采用ENVITM-18凈化柱所得回收率為70.2%～91.1%，RSD為9.3%，采用NH2凈化柱所得回收率為68.3%～80.7%，RSD為5.5%，采用QuEChERS法所得回收率為83.2%～97.2%，RSD為6.3%。

圖3 不同凈化方式的回收率比較結(jié)果Fig. 3 Statistical comparison of recovery results from different purification methods

由圖3可知，ENVITM-18凈化柱與NH2凈化柱所得回收率差異不顯著（P＞0.05），采用QuEChERS法的回收率顯著高于固相萃取小柱法（P＜0.05）。QuEChERS法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，固相萃取小柱法操作復(fù)雜，耗時(shí)較

長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用到的乙腈是一種有毒的有機(jī)溶劑，如果采用QuEChERS法，檢測(cè)1 個(gè)樣品只需要消耗20 mL乙腈，采用固相萃取小柱法需要消耗75 mL乙腈，因此，QuEChERS法可以作為一種較好的檢測(cè)手段來(lái)取代固相萃取小柱法，用于牛乳中喹氧靈的檢測(cè)。

2.3 方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

2.3.1 方法的準(zhǔn)確度和精密度

表2 方法的準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Accuracy and precision of the method

向不含喹氧靈的牛乳中添加5、10、20 μg/kg 3 種不同水平的喹氧靈標(biāo)準(zhǔn)品，做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6 次平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做2 次空白實(shí)驗(yàn)。由表2可知，平均回收率為83.2%～100.8%，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中對(duì)于回收率的要求。組內(nèi)RSD為2.1%～4.3%，組間RSD為4.3%，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度，可以作為檢測(cè)牛乳中喹氧靈的方法。被測(cè)組分含量＜0.1 mg/kg時(shí)，回收率為60%～120%。

2.3.2 方法的靈敏度

當(dāng)加標(biāo)量為5 μg/kg（GB 2763.1—2018中規(guī)定的喹氧靈限量值0.5 倍）時(shí)，喹氧靈的信噪比（RS/N）為19.3（3RS/N為方法檢出限，10RS/N為方法定量限）。因此在該加標(biāo)量下，喹氧靈可在儀器上定量檢出，確定出該方法的定量限為5 μg/kg。

2.4 牛乳中喹氧靈含量的測(cè)定

取75 個(gè)不同奶牛養(yǎng)殖戶(hù)的牛乳樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，75 個(gè)不同奶牛養(yǎng)殖戶(hù)的牛乳樣品中喹氧靈含量均低于GB 2763.1—2018規(guī)定的生乳中喹氧靈最大殘留限量0.01 mg/kg，可見(jiàn)，目前牛乳中喹氧靈殘留量較低，尚符合國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

利用QuEChERS法，采用乙腈作為提取溶劑，通過(guò)PSA和C18凈化樣品，建立牛乳中喹氧靈檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便、快捷、高效、靈敏度高。喹氧靈在牛乳中的回收率為83.2%～100.8%，該方法能夠達(dá)到靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度的要求。對(duì)75 個(gè)奶牛養(yǎng)殖戶(hù)的生乳進(jìn)行取樣并測(cè)定其喹氧靈含量，測(cè)定結(jié)果均低于限量值，可見(jiàn)，目前生乳中喹氧靈的殘留量尚處在一個(gè)較為安全的水平。GB 2763.1—2018對(duì)生乳中33 種農(nóng)藥最大殘留限量做了明確規(guī)定，喹氧靈只是其中的一種，今后還應(yīng)該對(duì)其他農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化研究，以便于更加全面地把控牛乳質(zhì)量。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳制定的《奶業(yè)品牌提升實(shí)施方案》中重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)將質(zhì)量作為奶業(yè)品牌發(fā)展的第一要義，構(gòu)建覆蓋全產(chǎn)業(yè)鏈的質(zhì)量監(jiān)管體系和高效安全的生產(chǎn)體系，確保生產(chǎn)出的產(chǎn)品安全優(yōu)質(zhì)、經(jīng)得起消費(fèi)者檢驗(yàn)[18-19]。要強(qiáng)化源頭生產(chǎn)管理，完善乳品檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，健全乳品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估制度，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并消除風(fēng)險(xiǎn)隱患[20]。乳品企業(yè)應(yīng)嚴(yán)把乳制品檢驗(yàn)關(guān)，讓消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)到放心的乳制品。