白掌疫病病原菌的鑒定

張?jiān)葡? 曾莎芮 黃耀華 陳燦鈿 程?hào)|美 向梅梅

摘 ?要 ?在致病性測(cè)定的基礎(chǔ)上，通過(guò)形態(tài)特征觀察及基于特異性引物Pn1和Pn2擴(kuò)增的DNA序列分析，對(duì)在廣州發(fā)現(xiàn)的白掌疫病的病原菌種類進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，引起廣州白掌疫病的病原菌為煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）。研究結(jié)果為白掌病害的防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?白掌;疫病;特異引物;煙草疫霉

中圖分類號(hào) ?S436.8 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?A strain was isolated from the diseased plants of Spathiphyllum sp. from Guangzhou. The Pathogenicity test showed the isolated strain was the pathogenic fugus of Spathiphyllum blight. The pathogenic strain was identified according to the morphology， rDNA internal transcribed spacer sequencing amplified by Pn1和Pn2. The result showed Phytophthora blight of Spathiphyllum from Guangzhou was caused by Phytophthora nicotianae. The result would provide a foundation for effective control of the disease.

Keywords ?Spathiphyllum sp. ; Phytophthora blight; specific primer; Phytophthora nicotianae

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.019

白掌（Spathiphyllum spp.），又稱白鶴芋、苞葉芋，屬于天南星科（Acreare），白鶴芋屬（Spathiphyllum），為多年生草本植物。白掌原產(chǎn)于美洲，20世紀(jì)80年代末引入中國(guó)。因其花型獨(dú)特，有“一帆風(fēng)順”寓意，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。廣東是白掌的主產(chǎn)地，近年來(lái)，作為主要的小盆栽觀葉植物，白掌的種植面積逐年增加。

作者在白掌病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，廣州某生產(chǎn)基地大面積發(fā)生疫病，受害植株莖基部腐爛，死亡率高達(dá)50%以上。為明確該病害的病原菌種類，為病害的防控提供理論依據(jù)，本研究對(duì)其病原菌進(jìn)行了鑒定。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試植株 ?病株樣品采自廣州某生產(chǎn)基地的大花白掌。接種植株為健康的大花白掌。

1.1.2 ??供試培養(yǎng)基 ?馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基用于菌株的分離培養(yǎng)和菌種的保存，馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液用于接種菌絲的培養(yǎng)，水瓊脂（WA）培養(yǎng)基用于單菌絲分離，V8汁培養(yǎng)基用于疫霉孢子囊和卵孢子的誘導(dǎo)。

1.2 ?方法

1.2.1 ??病原菌的分離純化 ?采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離[5]。具體方法如下：選取典型的病組織，自來(lái)水沖洗，晾干，于病健交界處切取3～5?mm2的若干小塊，依次于75%酒精消毒10～20?s、2.5%次氯酸鈉溶液消毒10～15?s、無(wú)菌水清洗3次;用無(wú)菌濾紙吸干組織塊表面的水分，將組織塊移至PDA平板上，每皿5塊，共6皿，于25?℃恒溫箱培養(yǎng)。

菌株的純化保存：待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落邊緣的菌絲移至新的PDA平板上純化;將純化后的菌株移接至PDA斜面上培養(yǎng)，于13?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

單菌絲分離：挑取少量菌絲，接種于WA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2～3 d后，在光學(xué)顯微鏡下切取單根菌絲，移植于PDA平板上，25?℃培養(yǎng)。

1.2.2 ?致病性測(cè)定 ?采用灌根法接種：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯幼苗，扒開表層土壤，用PD培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)3?d的菌絲懸浮液灌根，再用基質(zhì)覆蓋表層，并套袋保濕，以無(wú)菌水灌根為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。接種植株置于25～28?℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。

病原菌的再分離：采用常規(guī)組織分離法對(duì)接種發(fā)病植株的病組織進(jìn)行再分離，并通過(guò)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察確定分離菌株是否與接種菌株一致。

1.2.3 ?病原菌形態(tài)鑒定 ?菌落特征觀察：PDA平板上27?℃培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用無(wú)菌打孔器切取菌餅，移接至新的PDA平板上，菌絲面向下，27?℃培養(yǎng)，于2、4、6、8 d觀察并記錄菌落特征，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速率[6]。

顯微形態(tài)特征觀察：V8汁平板上培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用無(wú)菌打孔器切取菌餅，將菌餅移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿5塊，菌絲面向上，倒入無(wú)菌水至剛好沒(méi)過(guò)菌絲塊，25?℃培養(yǎng)2?d，觀察孢子囊及卵孢子形態(tài)并測(cè)量大小，孢子囊及卵孢子各測(cè)30個(gè)[6]。

1.2.4 ?病原菌分子鑒定 ?真菌基因組DNA的提?。?jiǎn)尉z菌株于PDA平板上培養(yǎng)3～5 d后，收集菌絲，參照Chi[7]的方法提取DNA。

PCR擴(kuò)增：分別用ITS的通用引物ITS1和ITS4[8]及煙草疫霉的特異引物Pn1和Pn2[9]進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃預(yù)熱5 min;94?℃變性30 s，56?℃退火45 s，72?℃延伸1?min，循環(huán)30次;72?℃終延伸10 min，4?℃保存。

DNA序列比對(duì)分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，送至英濰捷基生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行同源性比對(duì)。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：從NCBI網(wǎng)上下載可信度高的相關(guān)序列，用 MEGA 7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株及下載的序列進(jìn)行比對(duì)分析，以Fusarium solani作為外群，通過(guò)ML法（Maximum Likehood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)1000次重復(fù)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?白掌疫病的癥狀

病原菌沿根基部侵入，受害部位初期呈水漬狀，褐色，逐漸擴(kuò)展至內(nèi)部;剖開病株假鱗莖，心芽變褐色，病變沿心芽向上擴(kuò)展;受害植株最初表現(xiàn)葉片下垂、萎蔫，莖基部變褐濕腐，后期植株倒伏死亡。濕度大時(shí)，病害擴(kuò)展迅速，病株幾天內(nèi)倒伏死亡（圖1）。

2.2 ?致病性測(cè)定結(jié)果

健康植株接種7?d左右，葉片開始變黃、下垂，莖基部逐漸變褐色，濕腐狀，并向上蔓延，14 d左右植株倒伏死亡（圖2）;剖開假鱗莖，內(nèi)部呈黑褐色腐爛，與田間癥狀一致。取接種發(fā)病植株進(jìn)行組織分離，得到的菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)與接種菌株基本一致，說(shuō)明分離菌株為白掌疫病的病原菌。

2.3 ?病原菌的培養(yǎng)性狀及顯微形態(tài)

菌落白色，絮狀，邊緣整齊，初期菌絲稀疏，后期較致密（圖3A），平均生長(zhǎng)速度10?mm/d。孢子囊無(wú)色，倒梨形，頂生，具有明顯乳突，大小為（21.60～41.06）μm × （13.06～25.84）μm（av. = 31.57 μm × 22.11?μm）（圖3B）。卵孢子淺褐色，近圓形，大小為22.84～38.48 μm（av. = 28.44 μm）（圖3C）。厚垣孢子少，多間生。

2.4 ?病原菌的分子鑒定

用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)白掌疫霉病

A：受害植株癥狀;B：受害植株莖基部;C：受害植株莖基部?jī)?nèi)部。

用ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)菌株（PYA1和PYA2）與Phytophthora nicotianae聚為一支，形成一個(gè)明顯的分支，表明親緣關(guān)系較近因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將該病原菌鑒定為Phytophthora nicotianae。編號(hào)PYA1和PYA2分別為實(shí)驗(yàn)菌株ITS1/ITS4和特異引物Pn1/Pn2擴(kuò)增出來(lái)的2個(gè)序列，其他為NCBI上下載的可信度高的菌株序列。

3 ?討論

本文在致病性測(cè)定的基礎(chǔ)上，通過(guò)形態(tài)特征觀察及基于特異性引物Pn1和Pn2擴(kuò)增的ITS序列分析，對(duì)在廣州發(fā)現(xiàn)的白掌疫病的病原菌種類進(jìn)行了鑒定，明確引起廣州某生產(chǎn)基地白掌疫病的病原菌為Pythophthora nicotianae。

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