艾納香中綠原酸類化學(xué)成分研究

元超 王鴻發(fā) 胡璇 陳曉鷺 龐玉新

摘 ?要 ?為全面了解海南傳統(tǒng)黎藥艾納香抗菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用硅膠柱色譜、凝膠色譜以及高效液相色譜技術(shù)對(duì)艾納香提取物進(jìn)行系統(tǒng)化學(xué)成分研究。結(jié)果顯示：共分離鑒定6個(gè)綠原酸類成分：3，5-O-二咖啡?？崴嵋阴ィ?），3，5-O-二咖啡?？崴峒柞ィ?），3，4-O-二咖啡?？崴峒柞ィ?），3，4-O-二咖啡酰奎尼酸（4），3，5-O-二咖啡?？崴幔?），1，3，5-O-三咖啡?？崴幔?）。化合物1～6均為首次從該植物中分離得到，其中化合物1為新天然產(chǎn)物?？辜?xì)菌活性評(píng)價(jià)顯示化合物3對(duì)枯草芽孢桿菌及化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)抑制活性，MIC值均為64 ?g/mL，推測(cè)綠原酸類為艾納香的重要抗菌活性組成。

關(guān)鍵詞 ?艾納香;抗菌;綠原酸

中圖分類號(hào) ?R284 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?To comprehensively investigate the antimicrobial components of Blumea balsamifera （L.） DC.， a traditional Li Minority herb， various chromatographic methods including silica gel， sephadex LH-20 and ODS-A gel were used to study its chemical constituents. Six isolates including 3，5-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester （DAEE）， 3，5-O-di caffeoylquinic acid methyl ester （DAME）， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid methyl ester （OAME）， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid （DA1）， 3，5-O-dicaffeoylquinic acid （DA2） and 1，3，5-tri-O-caffeoylquinic acid （DA3） were obtained on the basis of detailed spectroscopic analysis. All compounds were isolated from the plant for the first time， and DAEE is a new natural product. Antimicrobial assay exhibited that OAME and DA3 displayed potent inhibitory activity against Bacillus subtilis （DSM 1088） and Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）， respectively， with MIC value 64 ?g/mL， suggesting chlorogenic acids maybe the main active ingredients of Blumea balsamifera （L.） DC.

Keywords ?Blumea balsamifera （L.） DC.; antibacterial; chlorogenic acids

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.020

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]為菊科（Compositae）艾納香屬（Blumea）多年生草本植物，為藥典中艾片的唯一來(lái)源植物[1]。其味辛、微苦、性溫、氣香，具溫中活血，消炎鎮(zhèn)痛，祛風(fēng)消腫等功效[2]，能夠治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、濕疹、皮膚瘙癢等癥[3]，作為傳統(tǒng)黎藥還被煮水用于婦女產(chǎn)后沐浴[4]。艾納香中主要成分為揮發(fā)油、黃酮類和萜類，目前從事艾納香非揮發(fā)性化學(xué)成分研究的主要包括廣西師范大學(xué)的朱廷春[5]，上海交通大學(xué)的陳銘[6]，深圳海王藥業(yè)的嚴(yán)啟新和譚道鵬等[7-8]，以及日本的Osaki等[9]和Osamu等[10]，共報(bào)道化學(xué)成分50多種，其中黃酮類32種，倍半萜類15種。已有研究對(duì)艾納香中的黃酮和萜類成分方面報(bào)道較多，相關(guān)生物活性主要集中在抗炎活性、細(xì)胞毒活性、血漿酶抑制活性等幾個(gè)方面，目前艾納香中綠原酸類成分尚未見研究報(bào)道。

綠原酸（chlorogenic acid）類化合物為金銀花的主要活性成分[11]，又稱咖啡?？崴?（caffeoy quinic acid）類化合物，是一類由奎尼酸和不同數(shù)目的咖啡酸通過(guò)酯化反應(yīng)縮合而成的酚酸類天然化合物，根據(jù)奎尼酸上不同位置取代咖啡?；鶖?shù)目的不同形成一系列的衍生物，具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗微生物作用，酶抑制活性，肝保護(hù)及抑制血小板凝聚等[12]。

艾納香作為具有較好抗菌活性的傳統(tǒng)黎藥在海南黎族百姓中被廣泛應(yīng)用，而通常一種藥用植物中的化學(xué)成分至少都在100種以上，目前對(duì)艾納香的化學(xué)成分方面的研究報(bào)道的化合物數(shù)量?jī)H50余種，遠(yuǎn)未達(dá)到其實(shí)際含有化學(xué)成分總量。為進(jìn)一步闡明艾納香作為傳統(tǒng)抗菌藥物的功效物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組擬在前人研究基礎(chǔ)上對(duì)艾納香中除黃酮類和萜類之外的非揮發(fā)性成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期從中發(fā)現(xiàn)其他結(jié)構(gòu)類型抗菌先導(dǎo)化合物，為闡明艾納香的傳統(tǒng)藥用功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供借鑒。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試材料 ?艾納香為2017年采自于海南省儋州市艾納香種質(zhì)資源圃，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera （L.） DC.，標(biāo)本保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所南藥室。

供試細(xì)菌菌株：Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799），Escherichia coli （DSM 1116） 和 Bacillus subtilis （DSM 1088） 均由青島大學(xué)藥學(xué)院李剛老師提供。

1.1.2 ?儀器與試劑 ?核磁共振波譜儀（Bruker Avance-500MHz）;液質(zhì)聯(lián)用儀：SYNAPT G2 HDMS超高效液相飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;Waters 2489半制備液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州廣源凈化科技有限公司）。

葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden）;ODS-A反相鍵和硅膠（北京慧德易科技有限責(zé)任公司）;高效液相色譜柱YMC-Pack ODS-A，10 ?m，250×10 mm（北京慧德易科技有限責(zé)任公司），100～200目柱層析硅膠和GF254薄層硅膠板（青島海洋化工有限公司）;石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）;色譜甲醇（TEDIA）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?化學(xué)成分的分離 ?艾納香葉片（6 kg），陰干，揉碎，用95%甲醇回流提取，合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味（400?g），水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分減壓濃縮至干，得乙酸乙酯浸膏（160 g）。

乙酸乙酯浸膏拌硅膠，上硅膠柱分離，依次用二氯甲烷/甲醇100/0～0/1梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜檢測(cè)，合并，獲得9個(gè)組分，分別編號(hào)A～I(xiàn)。I組分用甲醇溶解，上ODS反相鍵合硅膠色譜柱，用甲醇/水不同比例洗脫共得到3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%和100%共8個(gè)組分（I1～I(xiàn)8），將30%組分（I5）用甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱層析，甲醇為洗脫劑，根據(jù)薄層色譜檢測(cè)進(jìn)行合并，獲得單體化合物1（20?mg），2（51?mg）和3（17?mg）。將10%組分（I3）采用半制備高效液相色譜分離，依次獲得3個(gè)純化合物：4（14?mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=10.5 min），5（10 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=13.7 min），6（22 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=15 min）。

1.2.2 ?化合物1～6的抑菌活性測(cè)定 ?80?℃保存的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp. Aureus），大腸埃希菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株室溫解凍后，接種到LB液體培養(yǎng)基上，37?℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液濃度為1×108 CFU/mL。將其用MHB培養(yǎng)液（牛肉粉2?g，可溶性淀粉1.5?g，酸水解酪蛋白17.5?g，溶于1?L蒸餾水中，pH 7.4，高壓蒸汽滅菌）稀釋菌液100倍至106 CFU/mL，作為供試菌懸液。采用微量倍比稀釋法[13]測(cè)定化合物1～6（圖1）對(duì)3株供試菌的抑制活性，化合物1～6分別用DMSO溶解，供試樣品的濃度范圍為128～8 ?g/mL，培養(yǎng)板置37?℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，觀察結(jié)果，鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算最低抑菌濃度（MIC）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?結(jié)構(gòu)鑒定

2.2 ?抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用96孔板倍比稀釋法評(píng)價(jià)6個(gè)單體化合物的抑菌活性，鏈霉素為陽(yáng)性對(duì)照。活性結(jié)果（表1）顯示化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）具有較強(qiáng)抑制活性，MIC值為64 μg/mL，化合物3對(duì)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis （DSM 1088）也具有一定程度抑制活性，MIC值為64 μg/mL。

3 ?討論

艾納香作為海南傳統(tǒng)黎藥在民間用于清新口氣、沐浴以及外敷治療刀槍傷等外傷傷口，均具有很好的治療效果，暗示了艾納香抗菌以防治傷口感染和加速傷口愈合等方面的作用，黎族百姓親切地稱其為“熊貓葉”?，F(xiàn)有藥理學(xué)研究顯示，艾納香提取物具有很好的抑菌活性，如鄒婧等[19]報(bào)道艾納香葉提取物對(duì)4種口腔細(xì)菌具有較強(qiáng)抑制活性。陳艷等[20]研究顯示，艾納香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白色念珠菌具有很好的抑制活性，在0.6 mg/mL濃度下，對(duì)3株供試菌株的3個(gè)月抑制率均達(dá)到80%以上。

目前對(duì)艾納香化學(xué)成分的研究仍以左旋龍腦、艾油、總黃酮、萜類成分為主，據(jù)Pang等[21]2014年統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的艾納香非揮發(fā)性成分共50余種，幾乎全部為黃酮類化合物和倍半萜類成分，其他類型成分報(bào)道很少。藥用植物發(fā)揮一系列藥理功效的機(jī)制通常是多組分、多靶點(diǎn)的，各類成分之間還可能有協(xié)同作用，艾納香中的功效物質(zhì)，除了主要的黃酮類和萜類成分外，是否還含有其他結(jié)構(gòu)類型化合物對(duì)其藥用功效具有協(xié)同作用，目前尚不清楚。

Pang等[22]對(duì)艾納香總黃酮促進(jìn)大鼠皮膚愈合的研究顯示，艾納香總黃酮提取物具有保護(hù)傷口避免感染以及加速傷口愈合功效，研究中通過(guò)UPLC-Qtof-MS技術(shù)對(duì)總黃酮提取物的分析發(fā)現(xiàn)，除了黃酮類成分外，其中還含有不同種類的綠原酸類成分，綠原酸類化合物具有很好生物活性，尤其是抗菌方面，Zhu等[23]報(bào)道洋薊中的多種綠原酸類化合物對(duì)各種細(xì)菌和真菌表現(xiàn)出較好的抑制活性，MIC值50～200 μg/mL，因此推測(cè)艾納香中總黃酮為保護(hù)傷口和促愈合的主要功效成分，同時(shí)提取物中的綠原酸類成分可能對(duì)總黃酮的藥理功效具有協(xié)同作用。本研究從艾納香中分離并鑒定了多種綠原酸類單體成分，其中1種化合物為首次從自然界中分離獲得的新天然產(chǎn)物，6種單體化合物均為首次從該植物中分離，抗菌活性測(cè)試顯示多種綠原酸類成分對(duì)3種供試細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度抑制活性。

本研究不僅獲得一系列抗菌活性先導(dǎo)化合物，而且綠原酸類結(jié)構(gòu)為艾納香之前的研究中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)的一類活性成分，同時(shí)，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了Pang等[22]對(duì)總黃酮提取物的UPLC- Qtof-MS分析結(jié)果，有助于解釋綠原酸類成分在艾納香提取物的各種藥理功效中的可能發(fā)揮的協(xié)同作用。

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