朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄因子TcNrf2對抗氧化酶基因表達(dá)的調(diào)控功能初步研究

高錦濤 梁曉 伍春玲 陳青 陳謙

摘 ?要 ?轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對模式生物抗氧化酶的調(diào)控起關(guān)鍵作用，但迄今為止尚未見Nrf2具有對害螨抗氧化酶調(diào)控功能相關(guān)報道。本研究將模式生物研究中已知的Nrf2基因抑制劑、激活劑處理朱砂葉螨，通過抑制、激活其轉(zhuǎn)錄因子TcNrf2的表達(dá)，研究其對下游調(diào)控的抗氧化酶基因TcSOD和TcCAT表達(dá)的影響。結(jié)果表明，采用抑制劑護鴉膽子苦醇處理時，朱砂葉螨取食抗、感木薯品種1、4、8 d后，TcNrf2、TcSOD和TcCAT的基因表達(dá)量均顯著降低，而采用抑制劑視黃酸處理時上述基因表達(dá)不受影響;采用激活劑特丁基對苯二酚和二噻環(huán)戊二烯硫酮分別處理后，朱砂葉螨TcNrf2、TcSOD和TcCAT的基因表達(dá)量均顯著提高，說明TcNrf2及其調(diào)控的TcSOD和TcCAT基因表達(dá)量變化趨勢具有一致性。本研究從分子水平直接證明TcNrf2基因在木薯抗螨中具有重要作用，為木薯抗螨分子機理研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?木薯;朱砂葉螨;轉(zhuǎn)錄因子TcNrf2;調(diào)控功能

中圖分類號 S433.1;S433.7 ????文獻標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?The transcription factor Nrf2 plays a key role in the regulation of antioxidant enzymes in model organisms， but up to now， there was a lack of study indicating that Nrf2 can regulate antioxidant enzymes in mites. In this study， the Nrf2 inhibitors and activators were used to treat with the red spider mite （Tetranychus cinnabarinus）. The transcription of TcSOD and TcCAT were studied by inhibiting and activating the transcription factor TcNrf2. The results showed that the transcriptions of TcNrf2， TcSOD and TcCAT decreased significantly after feeding on mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars for 1， 4 and 8 d， while were not affected by retinoic acid treatment. However， the transcription of those genes significantly increased after treated by TBHQ （tert-butylhydroquinone） and D3T （1，3-dithiole-2-thione-4，5-dithiolat）， respectively， suggesting that the transcriptions of TcNrf2 and its regulated TcSOD and TcCAT genes were consistent. This study directly proves that TcNrf2 gene plays an important role in cassava mite resistance at the molecular level， which would lay a theoretical foundation for the molecular mechanism of mite resistance to cassava.

Keywords ?cassava; Tetranychus cinnabarinus; transcription factor TcNrf2; regulation function

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.018

木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界近8億人口賴以生存的主糧和重要的工業(yè)原料、飼料、生物質(zhì)能源和救荒作物[1]，在世界糧食安全、生物質(zhì)能源和食品加工等領(lǐng)域發(fā)揮著非常重要的作用，并作為“先鋒作物”在服務(wù)國家“一帶一路”發(fā)展戰(zhàn)略中的優(yōu)勢日益突出[2]。2018年8月22日國務(wù)院召開常務(wù)會議，明確加快建設(shè)木薯燃料乙醇項目。木薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展一直受到國家和省部領(lǐng)導(dǎo)的高度重視。

朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）是為害木薯最為嚴(yán)重的一種世界危險性害螨[3]，主要刺吸植物葉片汁液為害，引起葉片黃化，危害嚴(yán)重時導(dǎo)致整株死亡。目前該螨已在我國木薯種植區(qū)地嚴(yán)重發(fā)生與成災(zāi)，導(dǎo)致減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時減產(chǎn)50%～70%，嚴(yán)重制約了我國木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4]。由于該螨一般在種植后6～8個月成災(zāi)，但此時木薯地已封行，化學(xué)防治難度很大[5]。因此，尋求新的防治朱砂葉螨的方法已成為當(dāng)前木薯產(chǎn)業(yè)中亟待解決的重要問題。

培育與利用抗蟲品種是防治害蟲最經(jīng)濟、最有效、最簡便的一項帶有方向性的防治途徑，而研究害螨取食不同木薯種質(zhì)后對其生理生化的影響能夠為抗螨種質(zhì)資源的鑒定、評價與創(chuàng)新以及害螨的高效防治技術(shù)研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。研究表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)[6-7]。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，核因子NF-E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機制中發(fā)揮重要的作用[8-9]。Nrf2及其下游的抗氧化蛋白在調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化水平，改善病理生理變化等方面具有重要作用[10]。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)控抗氧化酶的功能已經(jīng)在人類[11]、模式生物如大鼠[12]、小鼠[13]、斑馬魚[14]、果蠅[15]有較多研究，研究范疇主要集中在疾病治療、炎癥發(fā)生、衰老、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)損傷和生殖發(fā)育等方面[16]。然而，包括朱砂葉螨在內(nèi)的農(nóng)業(yè)害螨中，Nrf2基因在朱砂葉螨-寄主植物互作中是否也行使調(diào)控抗氧化酶的功能尚缺乏相關(guān)報道。因此，本研究將模式生物研究中已知的Nrf2基因抑制劑、激活劑處理朱砂葉螨，通過干預(yù)其轉(zhuǎn)錄因子TcNrf2的表達(dá)，研究其對下游調(diào)控的抗氧化酶基因TcSOD和TcCAT表達(dá)的影響，從分子水平直接證明TcNrf2基因在木薯抗螨中具有重要作用，為木薯抗螨分子機理研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試木薯品種 ?對朱砂葉螨高抗木薯品種C1115和高感木薯品種BRA900由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯品種資源圃提供。

1.1.2 ?供試朱砂葉螨 ?供試朱砂葉螨由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?抑制劑、激活劑處理對朱砂葉螨死亡率的影響 ?用10%丙酮-水溶液依次配制濃度分別為5、10、20、40、80?μmol/L的上述5種化合物處理藥劑，以10%丙酮-水溶液為對照;依次將健康的、生長狀態(tài)一致的BRA900、C1115新鮮木薯葉片完全浸潤于上述溶液中10 s后用鑷子撈出，待葉片表面液體完全干燥后，按大約30頭/葉接種朱砂葉螨;朱砂葉螨為本實驗室繼代培養(yǎng)的生長狀態(tài)和齡期一致的雌成螨，每隔1、4、8?d后記錄每片葉上朱砂葉螨的累積死亡率。

1.2.2 ?抑制劑、激活劑處理對朱砂葉螨Nrf2及保護酶TcSOD和TcCAT表達(dá)量的影響 ?將1.2.1中與對照相比死亡率差異最小的抑制劑、激活劑濃度分別處理抗、感木薯葉片，并用于朱砂葉螨的室內(nèi)飼養(yǎng)，每葉50頭螨，待其分別取食1、4、8?d后收集存活的試螨用于qPCR測定，同時設(shè)置未用抑制劑、激活劑處理的朱砂葉螨作為對照。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。以朱砂葉螨的actin基因（XM_015930131.1）作為內(nèi)參，朱砂葉螨TcNrf2（XM_015928362.2）基因、抗氧化酶基因TcSOD（XM_015936131.2）和TcCAT（XM_025161768.1）的相對表達(dá)量變化情況以處理前的倍數(shù)表示，根據(jù)Livak的2ΔΔCt方法計算而得[17]。相關(guān)基因qPCR引物信息如表1所示。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法和Mann-Whitney U test，所有數(shù)據(jù)均為3個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，顯著性檢測水平為P<0.05。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Nrf2抑制劑、激活劑處理對朱砂葉螨死亡率的影響

當(dāng)用抑制劑BA處理后，朱砂葉螨取食感螨木薯BRA900和抗螨木薯C1115 1、4、8?d后的死亡率隨處理濃度的升高而升高（表2）。用抑制劑RA處理后，朱砂葉螨取食BRA900的死亡率與對照相比有顯著差異（P<0.05），但死亡率維持在低于10%的較低水平，而取食C1115后，除了20.00和10.00 μmol/L處理1 d的死亡率數(shù)據(jù)和對照有顯著差異外，其余各處理濃度死亡率與對照相比無顯著差異（表3）。用激活劑TBHQ（表4）和D3T（表5）分別處理時，在最高處理濃度條件下（20.00 μmol/L），朱砂葉螨取食BRA900的死亡率與對照相比雖然有顯著差異，但死亡率也僅分別低于13.33%和11.54%，而取食C1115后，除了第4天和第8天的死亡率在1.25和2.5?μmol/L處理濃度下與對照相比顯著降低外（P<0.05），其余濃度處理死亡率并無顯著差異。最終綜合考慮BRA900和C1115的結(jié)果，選擇與對照相比死亡率差異最小的濃度作為后續(xù)qPCR測定的處理濃度，即BA和RA均為1.25 μmol/L，?抑制劑、激活劑處理對朱砂葉螨TcSOD和TcCAT基因表達(dá)量的影響

抑制劑BA處理后，朱砂葉螨取食抗、感木薯品種的TcSOD和TcCAT的基因表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），并且取食C1115后降低幅度更大，TcSOD表達(dá)量分別達(dá)到了對照的0.31倍（1 d）、0.30倍（4 d）和0.26（8 d）倍（圖3B），TcCAT表達(dá)量分別達(dá)到了對照的0.42倍（1 d）、0.38倍（4 d）和0.36（8 d）倍（圖4B）。抑制劑RA處理后，朱砂葉螨取食抗、感木薯品種的TcSOD和TcCAT的基因表達(dá)量并無顯著變化（圖3，圖4）。而用激活劑TBHQ和D3T分別處理時，朱砂葉螨取食抗、感木薯品種的TcSOD和TcCAT基因表達(dá)量均顯著提高（P<0.05），并且取食BRA900后提高幅度更大，TBHQ處理TcSOD 表達(dá)量提高3.65倍（1 d）、3.68倍（4 d）和3.71（8 d）倍（圖3A），TcCAT表達(dá)量3.89倍（1 d）、3.92倍（4 d）和3.88（8 d）倍（圖4A）;D3T處理TcSOD表達(dá)量提高3.85倍（1 d）、3.86倍（4 d）和3.82（8 d）倍（圖3A），TcCAT表達(dá)量提高3.72倍（1 d）、3.76倍（4 d）和3.74（8 d）倍（圖4A）。

3 ?討論

研究轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對抗氧化酶的調(diào)控功能，能夠為揭示和理解害蟲（螨）-寄主植物互作規(guī)律及其寄主適應(yīng)性的形成原因，闡明害蟲（螨）為害的分子機理提供理論支持。一些研究表明，害蟲取食抗蟲植物會誘導(dǎo)自身抗氧化酶活性的顯著增加。例如Rigsby等[18]發(fā)現(xiàn)花曲柳吉丁蟲取食抗

A：BRA900;B：C1115;朱砂葉螨取食不同化合物處理過的木薯葉片1、4和8 d后TcNrf2基因表達(dá)量以取食未處理對照葉片的相對倍數(shù)表示，每個數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的結(jié)果，誤差線上不同字母表示TcNrf2表達(dá)量變化倍數(shù)差異顯著（P<0.05）。

A：BRA900;B：C1115;朱砂葉螨取食不同化合物處理過的木薯葉片1、4和8 d后TcSOD2基因表達(dá)量以取食未處理對照葉片的相對倍數(shù)表示，每個數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的結(jié)果，誤差線上不同字母表示TcNrf2表達(dá)量變化倍數(shù)差異顯著（P<0.05）。

A： BRA900; B： C1115; the changes in TcSOD transcript levels were presented as the fold of the levels in T. cinnabarinus while fed on different chemical-treated cassava leaves for 1， 4 and 8 d relative to those feeding on untreated leaves （controls）. Each data is average of three replications， and different letters above the columns indicated significant transcript levels （P<0.05）.

A：BRA900;B：C1115;朱砂葉螨取食不同化合物處理過的木薯葉片1、4和8 d后TcCAT基因表達(dá)量以取食未處理對照葉片的相對倍數(shù)表示，每個數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的結(jié)果，誤差線上不同字母表示TcNrf2表達(dá)量變化倍數(shù)差異顯著（P<0.05）。

吉丁蟲水曲柳后，體內(nèi)SOD和CAT的活性相比取食感性水曲柳顯著提高。胡黎華等[19]研究了橘小實蠅三齡幼蟲取食臍橙、桃、香蕉、番茄、黃瓜和西葫蘆6種寄主后保護酶SOD和CAT的活性變化，發(fā)現(xiàn)SOD和CAT活性在臍橙、桃和香蕉上顯著高于番茄、黃瓜和西葫蘆，作者認(rèn)為這些現(xiàn)象是臍橙、桃和香蕉成為橘小實蠅嗜好寄主的主要原因。相反，另外有研究表明抗蟲作物能夠顯著抑制害蟲抗氧化酶活性。例如Lu等[20]研究發(fā)現(xiàn)朱砂葉螨取食抗螨木薯品種后，抗氧化酶SOD和CAT的基因表達(dá)和酶活性與取食感螨木薯品種相比顯著降低，同時還導(dǎo)致了其發(fā)育與生殖被顯著抑制;Lu等[21]在另一項研究中也發(fā)現(xiàn)六點始葉螨取食抗螨橡膠樹品種（橡膠與木薯同為大戟科作物）后，體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT和POD（過氧化物酶）活性與取食感螨橡膠樹品種相比顯著降低。上述研究表明害蟲（螨）與寄主植物互作過程中體內(nèi)抗氧化酶基因表達(dá)水平和活性變化情況與取食的植物種類有關(guān)，并對害蟲（螨）的寄主適應(yīng)性產(chǎn)生影響。本研究中朱砂葉螨取食抗螨品種后體內(nèi)TcNrf2基因的表達(dá)被顯著抑制，而取食感螨品種時則不受影響，這可能與抗螨木薯抑制了朱砂葉螨保護機制的啟動，從而對其生理生化也產(chǎn)生了顯著抑制相關(guān)，這些結(jié)果需要通過干預(yù)TcNrf2的表達(dá)考察其對保護酶基因的調(diào)控作用進一步證實。

本研究結(jié)果表明朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄因子TcNrf2基因與保護酶基因的表達(dá)量變化趨勢相一致，從分子水平初步證實了TcNrf2對保護酶基因的調(diào)控功能。抑制劑BA顯著抑制了TcNrf2基因的表達(dá)，從而也導(dǎo)致朱砂葉螨取食抗、感螨木薯品種后TcSOD和TcCAT的表達(dá)量顯著降低，由于抗螨木薯C1115本身就對朱砂葉螨具有顯著的抑制作用，因此這2個基因被抑制的程度也大于取食感螨木薯。反之，抑制劑RA對TcNrf2未表現(xiàn)出抑制效果，因此TcSOD和TcCAT的表達(dá)量與對照相比也無顯著差異，而激活劑TBHQ和D3T均能顯著提高TcNrf2的表達(dá)，直接促進了2個保護酶基因表達(dá)量的顯著提高。本研究結(jié)果與小鼠[13]、果蠅[15]中抑制劑、激活劑處理后轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及抗氧化酶基因SOD和CAT的表達(dá)量同步提高的結(jié)果相一致。

Nrf2作為應(yīng)對外界應(yīng)激和脅迫的中央轉(zhuǎn)錄因子，除了能夠調(diào)控抗氧化酶，同時也能調(diào)控解毒酶例如細(xì)胞色素P450酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及其他一些保護蛋白表達(dá)的酶[22]，是潛在的害蟲防控新靶點。通過對轉(zhuǎn)錄因子Nrf2進行干預(yù)，破壞其對保護性酶和蛋白的調(diào)控功能，能夠最大限度削弱害蟲對氧化損傷的修復(fù)能力以及對有毒物質(zhì)的解毒能力。在果蠅Nrf2的研究中，已有學(xué)者提出該基因可能在害蟲抗藥性治理中具有較大應(yīng)用前景[23]，但目前該理論尚缺乏實踐基礎(chǔ)。本研究僅從轉(zhuǎn)錄水平證實抑制和激活轉(zhuǎn)錄因子TcNrf2的表達(dá)對下游保護酶基因表達(dá)的影響，下一步研究應(yīng)從蛋白水平證實TcNrf2對保護酶活性的調(diào)控功能，以及對朱砂葉螨生殖發(fā)育的影響，以期為將來把TcNrf2作為害蟲（螨）防治靶標(biāo)和可能的新基因資源應(yīng)用于作物抗蟲（螨）分子設(shè)計育種提供理論依據(jù)。

參考文獻

古 ?碧， 李開綿， 張振文， 等. 我國木薯加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)（農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)）， 2013， 11： 25-31.

李開綿， 陳 ?青， 黃 ?潔， 等. 中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略研究： 木薯分冊[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2016.

程立生. 中國朱砂葉螨各地理種群形態(tài)變異研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 1998， 1（1）： 83-86.

陳 ?青， 盧芙萍， 黃貴修， 等. 木薯害蟲普查及其安全性評估[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2010， 31（5）： 819-827.

李 ?遷， 盧芙萍， 陳 ?青， 等. 木薯品種對朱砂葉螨的抗性評價[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2015， 36（1）： 143-151.

Ray P， Huang B W， Tsuji Y. Reactive oxygen species （ROS） homeostasis and redox regulation in cellular signaling[J]. Cell Signal， 2012， 24（5）： 981-990.

Gechev T S， Van B F， Stone J M， et al. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death[J]. Bioessays， 2006， 28（11）： 1091-1101.

覃玉娥， 劉朝奇. Nrf2及其相關(guān)抗氧化基因的miRNA調(diào)控研究進展[J]. 生物技術(shù)通報， 2013， 8（9）： 34-37.

Denicola G M， Karreth F A， Humpton T J， et al. Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis[J]. Nature， 2011， 475（7354）： 106- 109.

Motohashi H， Yamamoto M. Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism[J]. Trends in Molecular Medicine， 2004， 10（11）： 549-557.

Pendyala S， Moitra J， Kalari S， et al. Nrf2 regulates hyperoxia-induced Nox4 expression in human lung endothelium： Identification of functional antioxidant response elements on the Nox4 promoter[J]. Free Radical Biology and Medicine， 2011， 50（12）： 1749-1759.

Buelnachontal M， Guevarachávez J G， Silvapalacios A， et al. Nrf2-regulated antioxidant response is activated by protein kinase C in postconditioned rat hearts [J]. Free Radical Biology & Medicine， 2014， 74（5）： 145-156.

Li Y， Cao Y， Wang F， et al. Scrotal heat induced the Nrf2-driven antioxidant response during oxidative stress and apoptosis in the mouse testis[J]. Acta histochemica， 2014， 116（5）： 883-890.

Wang L， Gallagher E P. Role of Nrf2 antioxidant defense in mitigating cadmium-induced oxidative stress in the olfactory system of zebrafish[J]. Toxicology and Applied Pharmacology， 2013， 266（2）： 177-186.

Sykiotis G P， Bohmann D. Keap1/Nrf2 Signaling Regulates Oxidative Stress Tolerance and Lifespan in Drosophila[J]. Developmental Cell， 2008， 14（1）： 80-85.

李雪麗， 唐 ?云， 許雪珠. 核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2最新研究進展[J]. 中國組織工程研究， 2012， 16（24）： 4530-4534.

Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-ΔΔCt）[J]. Methods， 2001， 25（5）： 402-408.

Rigsby C M， Showalter D N， Herms D A， et al. Physiological responses of emerald ash borer larvae to feeding on different ash species reveal putative resistance mechanisms and insect counter-adaptations[J]. Journal of insect physiology， 2015， 78（11）： 56-64.

王亞茹， 梁 ?曉， 伍春玲， 等. 木瓜秀粉蚧取食不同木薯品種后體內(nèi)保護酶活性差異分析[J].生物技術(shù)通報， 2018， 34（6）： 115-119.

胡黎華. 寄主轉(zhuǎn)換對橘小實蠅種群動態(tài)和抗氧化酶系的影響[D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2011.

Lu F， Liang X， Lu H， et al. Overproduction of superoxide dismutase and catalase confers cassava resistance to Tetranychus cinnabarinus[J]. Scientific Reports， 2017， 7： 40179.

Lu F， Chen Z， Lu H， et al. Effects of resistant and susceptible rubber germplasms on development， reproduction and protective enzyme activities of Eotetranychus sexmaculatus （Acari： Tetranychidae） [J]. Experimental and Applied Acarology， 2016， 9（4）： 427-443.

Andrew P， Dirk B. Mechanisms and functions of Nrf2 signaling in Drosophila[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2015， 88（Pt B）： 302-313.

Misra J R， Horner M A， Lam G， et al. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila[J]. Genes & Development， 2011， 25（17）： 1796-1806.