高場強MRI檢測JNK抑制劑作用的apoE-/-小鼠頸動脈早期斑塊

陸靜，姚玉宇，李冰，馬根山

東南大學附屬中大醫(yī)院心血管病研究所，江蘇南京 210009； *通訊作者 姚玉宇 yaoyuyunj@hotmail.com

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要驅(qū)動因素[1]。AS斑塊發(fā)生在動脈后壁及動脈分支開口處，緩慢的血流及湍流是AS形成的重要原因[2]。通過對apoE-/-小鼠頸動脈遠端結(jié)扎或在動脈外安放套管造成動脈近端血流速度下降形成低剪切力，從而形成頸動脈斑塊是研究AS斑塊的一種常見有效的動物模型[3-4]。apoE-/-小鼠頸動脈低剪切力可造成局部內(nèi)皮細胞損傷，致炎因子分泌，巨噬細胞聚集并進入內(nèi)膜形成AS斑塊[5]。

MRI具有高分辨率、多序列成像、可重復(fù)及無輻射等特點，已用于檢測AS斑塊大小、斑塊成分甚至判斷斑塊穩(wěn)定性[6]。小動物7.0T高分辨MRI可用于小鼠主動脈、頸動脈斑塊的檢測。本課題組前期采用MRI及超聲對 apoE-/-小鼠和 C57小鼠頸動脈低剪切力所致的斑塊進行動態(tài)觀察，并建立數(shù)學模型對斑塊穩(wěn)定性進行預(yù)測。研究顯示，MRI能活體、動態(tài)、高效、準確地檢測斑塊的進程[7]。本研究擬在apoE-/-小鼠頸動脈分支結(jié)扎模型上，使用 c-Jun NH2-terminal kinase（JNK）抑制劑，應(yīng)用超高場強7.0T Micro-MR檢測 JNK抑制劑對低剪切力誘導(dǎo)的頸動脈 AS斑塊的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立 所有動物實驗均經(jīng)我院實驗動物委員會批準。apoE-/-小鼠20只（購于常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK 2015-0013），2月齡，雄性。高脂飲食2周（Western Diet 21%脂肪，0.15%膽固醇，購于南京協(xié)同生物有限公司）。

1.1.1 小鼠頸動脈分支結(jié)扎術(shù) 采用 10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉小鼠后，仰臥位固定于手術(shù)臺，沿頸部正中線切開皮膚 1 cm，鈍性分離左側(cè)頸總動脈和4支分支血管（頸外動脈、頸內(nèi)動脈、枕動脈和甲狀腺上動脈），用6-0縫合線結(jié)扎左側(cè)頸外動脈、頸內(nèi)動脈和枕動脈，保留甲狀腺上動脈，縫合創(chuàng)口。造模小鼠隨機分為對照組和JNK-I組，每組10例。對照組腹腔內(nèi)注射溶劑PBS/DMSO；JNK-I組腹腔內(nèi)注射JNK抑制劑SP600125 0.1 mg/（kg·d）。2組小鼠分別于術(shù)后7 d和14 d行MRI檢測，第14天完成MRI后處死動物。

1.1.2 MRI檢查 所有掃描在Micro-MR小動物掃描儀（7.0T Bruker PharmaScans，Bruker Biospin，Ettlingen，Germany）進行?？讖酱笮?9 mm，射頻線圈直徑為25 mm，氣體麻醉劑異氟烷由山東科源制藥有限公司生產(chǎn)。小鼠在術(shù)后7 d及14 d分別進行超高場強 MR掃描。小鼠異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，仰臥位放至24 mm ID顯像床內(nèi)，異氟烷以低濃度、低流量維持，以控制小鼠呼吸頻率影像圖像質(zhì)量并避免掃描過程中體溫過低而死亡，連接呼吸監(jiān)控?？刂坪粑?0次/min。成像序列及參數(shù)：MSME-PD-T2WI自旋回波序列，進行小鼠頸總動脈成像。成像參數(shù)：TR 1206.9 ms，TE 12.8/34.2 ms，視野2.5 cm×2.5 cm，翻轉(zhuǎn)角180°，矩陣256×256，分辨率141 μm×141 μm×800 μm，層厚0.5 mm，平均激勵次數(shù)4次。掃描使用流動飽和使血液信號流空，使用壓脂技術(shù)減少化學位移偽影，每序列掃描18層。

1.1.3 MR圖像分析 所得圖像采用 ImageJ 1.41軟件測量小鼠頸動脈管腔直徑及斑塊體積。

1.2 Western blot檢測JNK的表達 MRI掃描后，采用大劑量10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死小鼠。剝離頸總動脈周圍組織，暴露游離兩側(cè)頸動脈，剪開右心房，由心尖部注入生理鹽水40 ml直至血管沖洗干凈，分別從主動脈弓出和頸內(nèi)、外動脈分叉處離斷血管。離斷頸動脈，放入液氮，研磨后加入蛋白裂解液用于蛋白提取。蛋白定量后，蛋白樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗孵育過夜（兔抗P-JNK，1∶1000，Cell Signaling公司；兔抗JNK，1∶1000，Cell Signaling公司），兔抗血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）抗體（1∶1000，Abcam公司）。隨后經(jīng)過洗膜，二抗孵育，ECL曝光顯色。

1.3 血管組織中 VCAM、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）mRNA表達檢測 頸動脈組織加入Trizol 200 μl，液氮研磨，按試劑盒方法進行RNA抽提及cDNA逆轉(zhuǎn)錄。以上述小鼠血管組織的cDNA為模板，用引物進行實時定量PCR擴增。VCAM-1引物：上游5′-AGTTGGGGATTCGGTTGTTC-3′，下游 5′-CATTCCTTACCACCCCATTG-3′；MCP-1引物：上游5′-CCTGCTGTTCACAGTTGC-3′，下游5′-TCATTGGGATCATCTTGC-3′；β-actin 引物：上游 5′-GTACCACCATGTACCCAGGC-3′， 下游5′-AACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。以 β-actin 作為內(nèi)參照，各組隨機選取3只小鼠檢測病變血管組織中VCAM-1及MCP-1 mRNA的表達。

1.4 病理檢測 離斷頸動脈立即OCT包埋，置于-80℃冰箱，待做冰凍切片。將OCT包埋的血管用恒溫冰凍切片機連續(xù)切片，每片8 μm。血管間斷取切片進行HE染色，普通光鏡觀察形態(tài)學改變。免疫組織化學染色（Universal Elite ABC，Vector）檢測巨噬細胞的標記CD68（Chemicon，1∶200）的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示。組間比較采用成組資料t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低剪切力誘導(dǎo)頸動脈斑塊體積比較 對血清脂質(zhì)的檢測顯示，對照組及 JNK-I組膽固醇分別為（12.1±1.9）mmol/L 和（11.9±2.3）mmol/L，三酰甘油分別為（2.2±0.2）mmol/L 和（2.2±0.3）mmol/L，組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。對照組7 d時患側(cè)表現(xiàn)為血管腔狹窄，血管壁增厚，14 d時狹窄程度顯著增加（圖1A）；對照組與JNK-I組14 d患側(cè)血管管腔直徑[（0.31±0.02）mm比（0.42±0.01）mm]、斑塊體積[（1.14±0.13）mm3比（0.58 ±0.06）mm3]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖1 MRI顯示JNK抑制劑顯著抑制低剪切力誘導(dǎo)的頸動脈斑塊體積。14 d血管壁增厚，管腔顯著狹窄；JNK-I組可見血管壁無明顯增厚

2.2 JNK抑制劑抑制低剪切力誘導(dǎo)的斑塊形成和炎癥反應(yīng) 對照組管腔顯著狹窄，而JNK-I組僅少量血管內(nèi)膜形成，與MRI結(jié)果相符合。CD68染色顯示對照組14 d時，CD68陽性細胞為（36.8±4.1）/高倍視野；JNK-I組14 d時，CD68陽性細胞為（13.7±3.6）/高倍視野。組間CD68陽性細胞比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果顯示，JNK-I組的動脈粥樣硬化明顯抑制，且炎癥細胞明顯少于對照組（圖2）。

2.3 Western blot及RT-PCR結(jié)果證實JNK抑制劑抑制低剪切力誘導(dǎo)的炎癥 Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，JNK-I組P-JNK水平顯著下降；而趨化因子VCAM-1的表達在JNK-I組顯著下降（P<0.05），見圖3。

圖2 JNK抑制劑抑制斑塊形成的代表性的病理結(jié)果。A.低剪切力誘導(dǎo)的斑塊形成，而JNK抑制劑顯著抑制斑塊形成（HE，×400）；B.CD68免疫組化顯示巨噬細胞在低剪切力組顯著增加，而JNK抑制劑抑制巨噬細胞聚集（×400）

低剪切力組顯著增加 MCP-1及 VCAM-1的表達，而JNK抑制劑抑制MCP-1及VCAM-1的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖4。

3 討論

AS是一種進展性的動脈病變，表現(xiàn)為血管內(nèi)膜脂質(zhì)、巨噬細胞、平滑肌細胞及細胞外基質(zhì)等聚集形成斑塊而造成動脈狹窄，是心腦血管疾病的主要原因[8]。多年來，通過對死后血管病理解剖的深入研究已對AS的病理及病理生理進行了一定程度的分析，但僅為回顧性結(jié)果。近十年，隨著影像技術(shù)的發(fā)展，研究者們通過侵入性的檢查，如血管造影、血管內(nèi)超聲、光學相干斷層攝影、拉曼光譜、近紅外光譜等，或者通過非侵入性檢查，如 CT、PET、MRI等對血管壁斑塊成像，極大地豐富了研究者對 AS的認識[9]。盡管血管造影和血管內(nèi)超聲已廣泛應(yīng)用于臨床工作，但仍急切需要非侵入性的檢查。

圖4 RT-PCR檢測各組VCAM-1及MCP-1的mRNA表達水平比較。注：與對照組比較，*P<0.05

MRI無創(chuàng)、無放射線污染并具有良好的高空間分辨率，日益得到研究者的重視。通過開發(fā) MRI不同序列，如T1/T2弛豫時間、質(zhì)子密度、擴散加權(quán)成像等，研究者不僅能判斷動脈管腔的狹窄程度，還能明確AS斑塊的成分[10-11]。本課題組一直致力于動脈斑塊的MRI研究，并已構(gòu)建Ox-LDL抗體、CTGF抗體、葉酸受體等不同靶向的磁性分子探針，在apoE-/-小鼠模型上觀察Ox-LDL、CTGF及巨噬細胞在斑塊中的分布[12-13]。本研究采用抑脂肪、黑血 MSME-PDT2WI自旋回波序列，T2WI對血管內(nèi)外壁及斑塊的邊界顯示較為清晰。PDWI信噪比較高，較T1WI和T2WI更能清晰地顯示斑塊的邊界和血管腔[14]。本組對照組apoE-/-小鼠14 d無論PD或T2WI序列均可見頸動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄；而JNK-I組14 d可見頸動脈壁并無明顯增厚。盡管本研究使用 7.0T高場強MRI，提示有較高的信噪比；但由于apoE-/-小鼠頸動脈的直徑不足0.5 mm，管壁更薄，故仍然無法分辨斑塊的各種成分。因此，在未來使用更高場強的MRI及發(fā)展匹配的專用線圈可進一步提高信噪比，開發(fā)有效的序列用于小血管 MRI，可深化小動物動脈血管AS研究。

炎癥在 AS斑塊形成中具有重要作用，巨噬細胞是AS發(fā)生、進展及出現(xiàn)并發(fā)癥的中心環(huán)節(jié)。套管所致的低剪切力可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷，釋放大量的趨化因子，如VCAM-1、MCP-1等，趨化單核巨噬細胞至病變部位，穿過內(nèi)皮細胞進入內(nèi)膜，吞噬脂質(zhì)并在局部沉積，導(dǎo)致AS斑塊形成[15]。Wang等[4]采用apoE-/-小鼠頸動脈放置套管模型上連續(xù)輸注JNK抑制劑10周，發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑顯著抑制斑塊形成，研究認為JNK抑制劑通過抑制NF-κB抑制VCAM-1的表達。本研究采用結(jié)扎頸內(nèi)動脈和頸外動脈的方法建立低剪切力模型，這種方法不會在頸動脈周圍因異物形成繼發(fā)性炎癥。采用 MRI動態(tài)觀察斑塊的形成，發(fā)現(xiàn)對照組在7 d即可見斑塊形成，14 d形成明顯的斑塊，造成管腔顯著狹窄；而JNK-I組在14 d僅有少量斑塊形成，HE染色證實了MRI結(jié)果。此外，CD68免疫組化染色顯示對照組巨噬細胞顯著增加，而JNK-I組僅少量巨噬細胞在內(nèi)膜下聚集。Western blot顯示P-JNK在抑制劑組表達顯著下降，而T-JNK在兩組間差異無統(tǒng)計學意義，表明JNK抑制劑抑制了JNK磷酸化，進而抑制了P-JNK活化所致的一系列信號通路。在炎癥狀態(tài)下，MCP-1是趨化單核細胞和淋巴細胞的重要趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MCP-1能抑制巨噬細胞進入血管壁[16-17]。JNK的磷酸化在MCP-1的表達及炎癥細胞的活化中起重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗中可見JNK抑制劑SP600125顯著抑制MCP-1的表達及炎癥細胞的聚集。同時，VCAM-1也是一個重要的趨化因子，JNK通過磷酸化活化NF-κB活化VCAM-1[4]。研究顯示，在結(jié)扎頸內(nèi)動脈及頸外動脈分支后的斑塊形成早期，VCAM-1高表達，SP600125顯著抑制VCAM-1蛋白及mRNA表達。因此，SP600125通過抑制JNK的磷酸化抑制炎癥抑制斑塊形成。

總之，通過對apoE-/-小鼠頸動脈分支結(jié)扎模型使用JNK抑制劑，利用超高場強7.0T Micro-MRI檢測JNK抑制劑對低剪切力誘導(dǎo)的早期頸動脈AS斑塊的變化，發(fā)現(xiàn)抑制JNK能顯著抑制頸動脈斑塊形成，高場強的 MRI是一種有效的研究方法，可用于動態(tài)觀察斑塊進程。