雌激素與雷洛昔芬治療骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究*

徐曉李興福歐陽(yáng)侃熊建義黃俊鋒王大平**段莉**

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州511436；2.深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518035；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭515063）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）又名絕經(jīng)期后關(guān)節(jié)炎。在40歲以上人群中高發(fā)，女性患者數(shù)量明顯高于男性，且與絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平的下降有直接聯(lián)系。相關(guān)研究[1,2]已經(jīng)證實(shí)，雌激素水平與OA發(fā)病存在聯(lián)系，關(guān)節(jié)軟骨也存在相應(yīng)的雌激素受體。關(guān)節(jié)軟骨是雌激素的靶組織之一。雌激素補(bǔ)充治療（hormone replacement therapy,HRT）臨床也已經(jīng)開(kāi)展。雷洛昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨作用，亦可抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用。臨床使用雷洛昔芬主要用于預(yù)防和治療婦女絕經(jīng)期的骨質(zhì)疏松癥。目前對(duì)于雷洛昔芬在OA治療方面的研究較少。構(gòu)建合適的動(dòng)物模型對(duì)于OA藥物治療方面的研究尤為重要。本文通過(guò)構(gòu)建大鼠OA模型，比較雌激素與雷洛昔芬在OA治療方面的差異，旨在為優(yōu)化OA治療方案提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

6月齡雌性SD大鼠42只，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適宜環(huán)境、溫度、濕度飼養(yǎng)一周后準(zhǔn)備動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)分配的原則分為兩組，每組21只。分別為自然組和造模大鼠組。造模大鼠組行卵巢切除術(shù)（ovariectomy,OVX）和半月板失穩(wěn)術(shù)（destabilization of the medial meniscus,DMM），自然組僅相應(yīng)部位切開(kāi)皮膚后縫合。詳細(xì)手術(shù)方法：通過(guò)腹腔注射水合氯醛水溶液（40 mg/kg）實(shí)施麻醉，常規(guī)消毒后，鋪單，從背側(cè)入路取雙側(cè)肋脊角下1.5 cm縱行切開(kāi)皮膚、肌肉，進(jìn)入腹腔，提拉出脂肪墊及卵巢，結(jié)扎卵巢動(dòng)靜脈、輸卵管，切除雙側(cè)卵巢。膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路切開(kāi)皮膚及關(guān)節(jié)腔，髕骨后外翻并膝關(guān)節(jié)屈曲，松解內(nèi)側(cè)副韌帶并眼科剪切除內(nèi)側(cè)半月板。逐層縫合后送回鼠籠。術(shù)后密切觀察大鼠生命體征。常規(guī)飼養(yǎng)兩個(gè)月后，Micro-CT掃描大鼠膝關(guān)節(jié)，判斷大鼠OA模型是否構(gòu)建成功。大鼠OA模型構(gòu)建成功后，按照隨機(jī)分配的原則，從自然組隨機(jī)抽取7只大鼠，組成空白對(duì)照組。造模大鼠組隨機(jī)分為OA模型組，雌激素補(bǔ)充組和雷洛昔芬注射組，每組各7只大鼠。自然組和OA模型組每天皮下注射等量生理鹽水，雌激素補(bǔ)充組和雷洛昔芬注射組每天分別皮下注射對(duì)應(yīng)藥物，雌激素（0.1 mg/kg），雷洛昔芬（3 mg/kg）。

1.2 Micro-CT掃描

藥物持續(xù)注射一個(gè)月后，脫頸處死，去除膝關(guān)節(jié)周?chē)l(fā)及部分肌肉，離斷股骨中段及脛腓骨中段，獲得大鼠離體膝關(guān)節(jié)，放置于10%中性福爾馬林中固定72 h。使用Micro-CT掃描大鼠離體膝關(guān)節(jié)，PANalytical微焦點(diǎn)X線球管掃描，參數(shù)設(shè)置為18μm，60 KV，385μA，并在180°的范圍內(nèi)進(jìn)行每次0.5°的旋轉(zhuǎn)。以大鼠離體膝關(guān)節(jié)股骨與脛腓骨連線為長(zhǎng)軸，關(guān)節(jié)囊中點(diǎn)為中心進(jìn)行掃描，之后使用1.6版本的NRecon軟件進(jìn)行三維重建、制圖并手工對(duì)感興趣區(qū)（regions of interest,ROI）進(jìn)行繪制，分析骨小梁數(shù)量（trabecular number,Tb.N）及骨小梁分離度（trabecular separation,Tb.Sp）等骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)。

1.3 組織切片

弱堿性脫鈣1個(gè)月后，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制作切片，隨后用蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差檢驗(yàn)齊性后，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，全部大鼠均無(wú)感染，無(wú)意外死亡。兩個(gè)月后發(fā)現(xiàn)造模大鼠組后肢均出現(xiàn)跛行。所有大鼠數(shù)據(jù)均進(jìn)入最終結(jié)果分析。

2.1 Micro-CT掃描結(jié)果

造模手術(shù)2個(gè)月后，OA模型組大鼠Micro-CT掃描結(jié)果可見(jiàn)軟骨周?chē)琴|(zhì)增生明顯，軟骨下骨原有結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。軟骨與軟骨下骨作為一個(gè)有機(jī)統(tǒng)一的整體，共同參與膝關(guān)節(jié)的承重功能。因此OA中，軟骨的退變可通過(guò)軟骨下骨反映。OA模型組大鼠正位片出現(xiàn)的特征性改變，說(shuō)明OA模型構(gòu)建成功。

持續(xù)給予藥物皮下注射1個(gè)月后，空白對(duì)照組軟骨下骨Tb.N高于OA模型組、雌激素補(bǔ)充組、雷洛昔芬注射組（P＜0.01）；OA模型組、雌激素補(bǔ)充組、雷洛昔芬注射組軟骨下骨Tb.N差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

空白對(duì)照組軟骨下骨Tb.Sp低于OA模型組、雌激素補(bǔ)充組、雷洛昔芬注射組（P＜0.01）；OA模型組、雌激素補(bǔ)充組、雷洛昔芬注射組軟骨下骨Tb.Sp差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖1治療1個(gè)月后，4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨小梁數(shù)量比較

2.2 組織切片結(jié)果

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片蘇木精-伊紅染色顯示，空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨層次清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，基質(zhì)著色均勻；OA模型大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)基質(zhì)已完全破壞，各層次結(jié)構(gòu)紊亂無(wú)序，無(wú)法辨認(rèn)；雌激素補(bǔ)充組，關(guān)節(jié)原有結(jié)構(gòu)維持尚可，染色均勻，細(xì)胞數(shù)量稍增多，排列略紊亂，軟骨面略粗糙；雷洛昔芬注射組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)基質(zhì)原有結(jié)構(gòu)破壞，軟骨層變薄，染色不均，排列紊亂，軟骨面粗糙（圖3）。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是臨床工作中的常見(jiàn)病和高發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)65歲以上人群中，OA的發(fā)病率達(dá)50%，75歲以上人群中OA患病率達(dá)85%[3]。隨著全球老齡化人口逐年增長(zhǎng)，已有學(xué)者[4]推測(cè)，OA極有可能成為全球第四大致殘性疾病。OA發(fā)病呈現(xiàn)性別差異，絕經(jīng)期后的女性患者遠(yuǎn)多于男性患者。隨后的研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，女性O(shè)A患病率的增加與體內(nèi)雌激素水平的下降趨勢(shì)相同。現(xiàn)已證實(shí)，雌激素通過(guò)與軟骨上的雌激素受體結(jié)合，直接參與軟骨細(xì)胞生理行為的調(diào)控。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨也能自主合成雌激素[8]，并通過(guò)與其受體作用，增強(qiáng)雌激素受體的敏感性，進(jìn)而調(diào)節(jié)雌激素對(duì)軟骨細(xì)胞的影響[9]。雌激素也參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)中各種生物活性因子，進(jìn)而對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的生理結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響[10,11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠切除卵巢2個(gè)月后，大鼠行走出現(xiàn)跛行，組織切片結(jié)果可見(jiàn)軟骨層原有結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)一步證實(shí)雌激素水平的下降可引發(fā)OA。

圖2治療1個(gè)月后，4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨小梁分離度比較

在構(gòu)建鼠類(lèi)OA模型方面，目前常用的造模方法有3類(lèi)：①關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)[12-14]；②關(guān)節(jié)內(nèi)藥物注射[15-17]；③基因敲除模型。因?yàn)榘朐掳宓那谐绊g帶的離斷并沒(méi)有直接對(duì)軟骨產(chǎn)生破壞，由此產(chǎn)生的軟骨病變類(lèi)似OA模型早期，極適合藥物治療方面的研究，所以本次實(shí)驗(yàn)選用的是OVX+DMM的方式進(jìn)行造模。通過(guò)OVX+DMM的手術(shù)方式，選取6月齡SD大鼠成功構(gòu)建了OA模型，說(shuō)明OVX+DMM是一種可靠、快速的造模方式。

雌激素在軟骨細(xì)胞正常生理功能維持中扮演重要角色[18]。因此臨床中也開(kāi)展了HRT療法[19]，但是雌激素的長(zhǎng)期補(bǔ)充會(huì)帶來(lái)明顯的不良反應(yīng)，甚至引起乳腺癌等惡性疾病的發(fā)生。進(jìn)一步的研究[20]發(fā)現(xiàn)，雌激素受體有α和β 2種亞型，雌激素與不同的受體亞型結(jié)合，可產(chǎn)生不同的效果?；诖萍に厥荏w功能性的差異，人工合成選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen receptor modulator,SERMs）也逐步用于臨床[21]。目前已經(jīng)研發(fā)出多種SERMs,可以特異性的結(jié)合對(duì)應(yīng)的α或β受體，引起不同的作用[21]。其中典型的SERMs代表就是雷洛昔芬。雷洛昔芬可以特異性結(jié)合雌激素受體α，在骨組織起雌激素樣作用，在生殖系統(tǒng)起抗雌激素作用[22]。作為一種較為理想的SERMs，雷洛昔芬已廣泛用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥[23]。但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于雷洛昔芬能否治療OA的研究開(kāi)展較少。

Lories等[24]提出骨-軟骨復(fù)合體這一概念后，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨、軟骨下骨等多種組織結(jié)構(gòu)共同參與OA發(fā)生發(fā)展[25,26]。因此，本次研究設(shè)想，能否通過(guò)使用雷洛昔芬來(lái)治療OA，無(wú)論是從雷洛昔芬在治療軟骨下骨骨質(zhì)疏松的角度，還是雷洛昔芬直接作用于軟骨細(xì)胞。本次研究結(jié)果尚未發(fā)現(xiàn)雷洛昔芬在OA領(lǐng)域的治療作用。Micro-CT結(jié)果顯示，大鼠軟骨下骨產(chǎn)生骨質(zhì)疏松后，給予雷洛昔芬治療，并不能使骨質(zhì)疏松程度減輕。組織切片結(jié)果也提示，雷洛昔芬對(duì)于軟骨退變沒(méi)有治療作用。當(dāng)大鼠去勢(shì)后，體內(nèi)雌激素水平迅速下降。去勢(shì)手術(shù)2個(gè)月后，軟骨下骨出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)疏松。補(bǔ)充雌激素后，軟骨下骨骨質(zhì)疏松情況并未改善，而組織切片顯示大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變明顯好轉(zhuǎn)。本次研究發(fā)現(xiàn)雌激素是直接作用于軟骨發(fā)揮保護(hù)作用，并不是先對(duì)軟骨下骨發(fā)揮作用。而Zhen等[27]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨損傷可引起軟骨下骨結(jié)構(gòu)改變，形成一個(gè)類(lèi)骨質(zhì)島，從而使軟骨下骨上的軟骨張力增加，誘發(fā)軟骨發(fā)生進(jìn)一步的病理學(xué)改變。這表明，臨床醫(yī)師通過(guò)補(bǔ)充雌激素來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎，也僅是暫時(shí)性的減緩了關(guān)節(jié)軟骨退變，由于軟骨下骨結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞，一旦終止補(bǔ)充雌激素，軟骨由于沒(méi)有了軟骨下骨的支撐及營(yíng)養(yǎng)，又快速退變而再次產(chǎn)生OA。此外，雌激素本身的特性導(dǎo)致OA患者無(wú)法長(zhǎng)期持續(xù)補(bǔ)充雌激素。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臨床常用藥物雷洛昔芬，作為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，對(duì)OA沒(méi)有治療作用。

圖3各組膝關(guān)節(jié)軟骨蘇木精-伊紅染色（上40×，下100×）

綜上，本次研究表明，OVX+DMM是一種快速有效的造模方式，可以在大鼠OA藥物研究領(lǐng)域推廣。雌激素對(duì)于大鼠骨關(guān)節(jié)炎有治療作用，僅表現(xiàn)在治療軟骨退變，對(duì)于軟骨下骨的骨質(zhì)疏松并無(wú)改善。臨床常用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎沒(méi)有治療作用。雌激素治療OA又存在諸多的不足及副作用，因此，亟須研發(fā)新型選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，用于高效、特異性治療OA。