后縱韌帶骨化致病相關(guān)候選基因及單核苷酸多態(tài)性研究進(jìn)展*

陳峰江詩陶△ 馬鴻杰胡建華**

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京100730；2.鄭州市骨科醫(yī)院骨科，鄭州450052）

后縱韌帶骨化（ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL）起病多隱匿，患病早期常無明顯臨床癥狀，隨病情進(jìn)展，后縱韌帶塊狀骨化組織出現(xiàn)，脊髓因此受到由前向后的直接壓迫，導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)壓縮變形，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)細(xì)胞損傷、壞死，同時(shí)脊髓白質(zhì)亦因壓迫而出現(xiàn)脫髓鞘改變，在這個(gè)慢性病程中，如果壓迫損傷加重則可能出現(xiàn)脊髓壞死加重或脊髓軟化病變，造成患者神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。有研究報(bào)道OPLL更常見于東亞人群，其中以日本人群發(fā)病率最高，為1.9%～4.3%。非亞洲人群，如歐美人群，其發(fā)病率約為0.01%～1.70%[1]。導(dǎo)致OPLL病因很多，主要包括基因、年齡、種族、創(chuàng)傷、生物力學(xué)因素等，因此發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。近年來在上述各個(gè)方面都有較為深入的研究嘗試闡釋相關(guān)病因的發(fā)病機(jī)制，隨著分子生物學(xué)及基因組學(xué)的飛速發(fā)展，對OPLL相關(guān)遺傳因素，特別是基因和單核苷酸多態(tài)性的研究也取得了長足的進(jìn)步。本文嘗試就該領(lǐng)域內(nèi)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 OPLL相關(guān)候選基因與單核苷酸多態(tài)性（sin-gencetd oyopism SNP）

OPLL受多個(gè)基因影響，結(jié)合目前已有的研究結(jié)果，與OPLL相關(guān)的熱點(diǎn)候選基因主要包括：轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1）、人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）、膠原蛋白（collagen，COL）和成纖維生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）等。

1.1 TGF-β家族和SNP

TGF-β是一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的超家族，包含超過40個(gè)成員，包括TGFβs，Nodal，Activin和BMPs[2]。 有研究[2]表明TGF-β/BMPs信號(hào)傳導(dǎo)及其與MAPK，Wnt，Hedgehog，Notch和FGF信號(hào)通路的交互作用在骨形成中起重要作用。TGF-β在骨和軟骨中大量存在，其中還含有大量TGF-β靶細(xì)胞。TGF-β通過自分泌和旁分泌維持和擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）/祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞祖細(xì)胞[2,3]。因此，TGF-β基因，特別是TGF-β1，由于其在調(diào)節(jié)骨代謝中的重要性，因此被認(rèn)為是增加OPLL易感性的主要候選基因[4,5]。TGF-β常存在于異位骨化基質(zhì)和軟骨細(xì)胞中，通常不存在于MSCs和非骨化韌帶中，這表明TGF-β可能在異位骨化的后期刺激骨形成[6]。

在OPLL發(fā)病機(jī)制中，TGF-β1基因外顯子1的869T＞C多態(tài)性已經(jīng)得到較為深入的研究，但目前結(jié)果尚有一定爭議。Kamiya等[4]最先報(bào)道了869T＞C多態(tài)性是頸椎后縱韌帶骨化易感性的遺傳決定因素，869T＞C的C等位基因是后縱韌帶骨化遺傳易感性的危險(xiǎn)因素。然而，其他3項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)869T＞C多態(tài)性與大規(guī)模研究中后縱韌帶骨化的患病率無顯著相關(guān)性[5,7,8]。然而，進(jìn)一步的分層分析卻顯示，有869T＞C的C等位基因的患者在頸椎、胸椎或腰椎中更頻繁地出現(xiàn)后縱韌帶骨化[9]。此外，TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)的-509C＞T多態(tài)性與后縱韌帶骨化無顯著相關(guān)性[8]。

2006年Horikoshi等進(jìn)行一項(xiàng)病例對照研究表明，rs226862和rs22847的TGF-β3多態(tài)性與OPLL顯著相關(guān)，其中rs226862多態(tài)性與OPLL的相關(guān)性最為顯著，位于內(nèi)含子深處[7]。已有研究[10]發(fā)現(xiàn)TGF-β受體2（TGFBR2）基因的3種多態(tài)性與OPLL相關(guān)：455-4T＞A，571G＞A和95-35C＞T。TGF-β的生理功能在骨代謝中發(fā)揮重要作用，因此有理由認(rèn)為其在OPLL的病理生理學(xué)中有關(guān)鍵的潛在作用，但是由于部分研究存在爭議，仍需要額外的遺傳和功能研究來揭示它們的真實(shí)性和具體作用。

1.2 BMP基因和SNP

作為TGF-β家族的一部分，BMPs是刺激成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的最關(guān)鍵的生長因子，可以促進(jìn)骨和軟骨形成。BMP介導(dǎo)的Smad信號(hào)傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子中起重要作用，如Runx2，Osterix，Msx2，Dlx5/6和Sox9[11]。遺傳和生化研究[12]表明這些轉(zhuǎn)錄因子對成骨細(xì)胞生成和軟骨形成至關(guān)重要，其中BMP-2、BMP-7有促進(jìn)骨融合的作用，缺乏BMP的調(diào)節(jié)后縱韌帶部位則不易發(fā)生骨化。另外有研究表明BMP受體和BMPs在后縱韌帶骨化組織中都有異常的表達(dá)模式。BMP受體在OPLL的骨化韌帶中的表達(dá)水平顯著高于非OPLL組織。此外，OPLL標(biāo)本中后縱韌帶的非骨化片段也比非后縱韌帶骨化組織更大程度地表達(dá)BMP受體[13]。BMP-2存在于OPLL的相鄰軟骨區(qū)域的骨化基質(zhì)和軟骨細(xì)胞中，還存在軟骨區(qū)域附近的MSC中[6]。這些研究表明BMP的分子改變先于OPLL的發(fā)展，即BMP可刺激間充質(zhì)祖細(xì)胞的分化并且作為OPLL發(fā)展的起始因子發(fā)揮作用。諸多研究揭示了BMP的單核苷酸多態(tài)性與OPLL之間的關(guān)聯(lián)。一些報(bào)道顯示，OPLL中rs2273073（T/G）和rs235768（A/T）多態(tài)性的頻率顯著高于對照組。兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性都與中國漢族人群中OPLL的發(fā)生有關(guān)[14-17]。rs2273073（T/G）SNP的功能分析顯示該突變可異常激活BMP-Smad信號(hào)傳導(dǎo)。有研究[18]認(rèn)為轉(zhuǎn)染這種BMP2突變體可促進(jìn)p-Smad1/5/8的活化，Smad4的表達(dá)并增加堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的活性。單軸循環(huán)拉伸可以促進(jìn)成骨分化并可在有 rs2273073（T/G）的 BMP2基因突的C3H10T1/2細(xì)胞中促進(jìn)BMP2的合成[14]。然而，Kim等[19]報(bào)道，在韓國人群中OPLL和非OPLL組間兩種BMP2 SNP沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)的多樣性可能是由于這兩個(gè)種群間遺傳背景的變化所致。

1.3 ENPP1

ENPP1是一種Ⅱ型跨膜金屬酶，其功能是調(diào)節(jié)軟組織鈣化和骨組織礦化。它通過產(chǎn)生焦磷酸起到鈣化抑制劑的作用[20]。OPLL小鼠模型能夠表現(xiàn)脊柱韌帶病理性骨化的自然發(fā)生過程，如后縱韌帶骨化，髓核增大，纖維環(huán)軟骨組織的再生增殖，原始間充質(zhì)細(xì)胞和脊柱韌帶成骨細(xì)胞的新生血管和化生等[21,22]。ENPP1在研究中被認(rèn)為與該突變表型有關(guān)，即ENPP1基因的突變導(dǎo)致在該模型小鼠的基因組中插入了異常的終止密碼子[23]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)ENPP1中的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性與人類OPLL的發(fā)展或嚴(yán)重程度相關(guān)。一個(gè)是IVS15-14T，內(nèi)含子15中的T→C轉(zhuǎn)換[7,10]，第二個(gè)是IVS20-del11T，內(nèi)含子20中剪接受體位點(diǎn)上游11個(gè)核苷酸處的T缺失[24]。其余兩個(gè)涉及編碼區(qū)：A533C是外顯子4中的A→C變化，其將蛋白質(zhì)序列從K改變?yōu)镼，C973T是外顯子9中的C→T取代。有IVS20-del11T或A533C的患者術(shù)后無疾病進(jìn)展可能性為不具有該類基因人群的3倍以上。這可能成為手術(shù)預(yù)后的參考指標(biāo)[25]。

1.4 膠原蛋白基因

COL主要參與骨和軟骨的形成，并介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞表面蛋白之間的相互作用。膠原基因的突變和/或異常表達(dá)可以在結(jié)締組織中誘導(dǎo)各種病理表型。目前研究顯示許多膠原蛋白基因與OPLL相關(guān)，包括 COL11A2[26-29]，COL6A1[18]和 COL17A1[30]。COL11A2是XI型膠原蛋白，能與II型膠原蛋白結(jié)合，后者是軟骨的主要膠原成分。已發(fā)現(xiàn)COL11A2與OPLL的易感性顯著相關(guān)[26,29]。相關(guān)研究推測外顯子7與COL11A2內(nèi)含子6（-4A）中去除的外顯子6一起在異位骨化過程中發(fā)揮保護(hù)作用[27,28]。另外，已發(fā)現(xiàn)COL6A1的3種不同單核苷酸多態(tài)性與OPLL相關(guān)：啟動(dòng)子（-572T），內(nèi)含子 32（-29）和內(nèi)含子 33（+20）[5,31-33]。Wei等[30]發(fā)現(xiàn)的COL17A1的兩個(gè)單核苷酸多 態(tài) 性 ，即 rs805698（c.G1282A，p.G428S）和rs4918079（c.C2595T，p.R865R）與后縱韌帶骨化癥顯著相關(guān)。盡管膠原基因在細(xì)胞外基質(zhì)支架形成過程中發(fā)揮作用，并且可能促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化，但上述膠原基因的單核苷酸多態(tài)性在OPLL發(fā)病機(jī)制中的特定作用仍需要進(jìn)一步研究。

1.5 HLA和FGFR-1

Sakou等[34]的研究表明位于6號(hào)染色體上的HLA單倍體型也涉及到脊柱韌帶骨化的發(fā)生，OPLL患者的單核苷酸多態(tài)性常在調(diào)節(jié)骨、軟骨、韌帶代謝的基因中表現(xiàn)出差異；另一方面生物力學(xué)因素與脊柱生理功能失調(diào)會(huì)影響韌帶組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)并最終導(dǎo)致其失去正常修復(fù)能力，最終引起炎癥、加劇韌帶組織異常修復(fù)，進(jìn)而相關(guān)基因誘導(dǎo)異常表達(dá)最終導(dǎo)致韌帶骨化的發(fā)生。

Jun等[35]為了確定FGF2基因、FGFR1、FGFR2基因和OPLL多態(tài)性之間的相關(guān)性,對9個(gè)基因（FGF2：rs1476217,rs308395,rs308397,rs3747676;FGFR1:rs13317，rs2467531;FGFR2:rs755793,rs1047100,and rs3135831)的SNPs進(jìn)行了基因分型。在SNPs中,FGFR1中的SNP(rs13317)與OPLL在共顯性中的易感性顯著相關(guān)。并且FGFR-2的SNP與OPLL疾病狀況及進(jìn)展關(guān)系密切。

1.6 其他可能與OPLL相關(guān)的生物標(biāo)志物

硬化蛋白（Sclerostin）和Dickkopf-1（DKK1）是Wnt/β-catenin信號(hào)拮抗劑，其在骨形成中起重要作用。Sclerostin水平反映了年齡相關(guān)骨量和周轉(zhuǎn)率的變化。隨著衰老，個(gè)體骨細(xì)胞的Sclerostin分泌增加[36]。刪除DKK1基因的單個(gè)等位基因會(huì)導(dǎo)致骨形成和骨量增加。男性O(shè)PLL受試者組的血清Sclerostin水平顯著高于對照組，與年齡和全髖骨密度呈正相關(guān)。血清Sclerostin和DKK1水平在男性O(shè)PLL受試者中呈負(fù)相關(guān)。在男性O(shè)PLL受試者中，Sclerostin的分泌也隨著年齡的增長和更高的骨量而增加。

瘦素是一種脂肪細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，被認(rèn)為是后縱韌帶骨化發(fā)病的重要因素。Feng等[37]研究發(fā)現(xiàn)女性血清瘦素濃度高于男性。與非OPLL女性相比，OPLL女性中血清瘦素和ALP濃度顯著增加。在OPLL受試者中，針對體質(zhì)指數(shù)校正的血清瘦素濃度與ALP濃度呈負(fù)相關(guān)。在OPLL細(xì)胞中，應(yīng)用瘦素后導(dǎo)致ALP和骨鈣素(osteocalcin,OCN)的mRNA表達(dá)顯著增加并形成礦化結(jié)節(jié)。研究認(rèn)為瘦素在OPLL細(xì)胞中的成骨作用可以通過ERK1/2，p38 MAPK和/或JNK信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)。

綜上，后縱韌帶骨化的相關(guān)候選基因及SNP位點(diǎn)匯總見表1。

目前還有白介素[44,45,49,58]、雌激素受體[5,49,50]、維生素[39,52]、Toll樣受體[46]、α2-HS糖蛋白[5]、類視黃醇X受體-β[51]、人類血管緊張索轉(zhuǎn)換酶[48]等相關(guān)基因及部分SNP位點(diǎn)也逐步被揭示。

2 OOPPLLLL發(fā)病機(jī)制假說

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)和理論體系，筆者提出后縱韌帶骨化發(fā)病機(jī)制的初步假說。在機(jī)械應(yīng)力、炎癥反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄和通路負(fù)調(diào)控和基因突變的多重作用之下，可以引起B(yǎng)MP和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活，接著Smad蛋白和絲裂原活化蛋白激酶上調(diào)，Sox9，Runx2和Osterix的轉(zhuǎn)錄相應(yīng)增加，其可以調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞，成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化和增殖，并最終導(dǎo)致OPLL形成和進(jìn)展（圖1）。

3 研究展望

目前為了鑒定OPLL相關(guān)的遺傳和環(huán)境因素研究者們已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試。尤其最近基于大規(guī)模樣本的GWAS分析顯著縮小了可能含有OPLL的關(guān)聯(lián)基因在染色體上的功能位置。然而，我們還需要更有效的研究方法和統(tǒng)計(jì)分析來鑒定來自這些區(qū)域的靶基因。盡管數(shù)十年來已經(jīng)揭示了許多OPLL樣本中出現(xiàn)的特定單核苷酸多態(tài)性，但大多數(shù)研究都基于小樣本和少量樣本序列。因此，基于全基因組或外顯子組的下一代測序方法將有助于縮小該差距。關(guān)于TGF-β/BMP信號(hào)及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的進(jìn)一步研究可能會(huì)幫助我們更深入地理解后縱韌帶骨化發(fā)生及進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制，同時(shí)，隨著研究進(jìn)展我們會(huì)發(fā)現(xiàn)更多后縱韌帶骨化發(fā)生的相關(guān)因素，理清各因素之間的主次關(guān)系及相互影響的機(jī)理將是未來研究的方向之一。

表1后縱韌帶骨化候選基因及SNP研究結(jié)果匯總

圖1后縱韌帶骨化發(fā)病相應(yīng)因素及機(jī)制假說