滇黃精總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

李小紅 楊顯輝 李安

摘要：以滇黃精為原料，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計對其總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝條件進行優(yōu)化，并研究滇黃精總黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的清除能力及小鼠肝組織脂質(zhì)自氧化能力。結(jié)果表明，滇黃精總黃酮超聲輔助雙水相提取的最佳工藝條件為超聲時間32 min、硫酸銨用量0.39 g/mL、液料比為 24 mL ∶ 1 g，此時獲得的總黃酮提取率為6.21%;滇黃精總黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基均有較強的清除能力，且能抑制小鼠肝組織脂質(zhì)自氧化能力。

關(guān)鍵詞：滇黃精;總黃酮;雙水相;超聲波;抗氧化

中圖分類號： R284.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0234-04

黃精、滇黃精或多花黃精為百合科黃精屬植物，其干燥根莖為藥食同源性中草藥，味甘性平，主要含有黃精多糖、黃酮、皂苷、氨基酸及微量元素等多種成分，具有補中益氣、益腎強骨、健脾潤肺、增強免疫功能、延緩衰老、調(diào)血脂、降血糖等功效[1-3]。目前，對黃精多糖的研究相對較多，而對黃精中黃酮類化合物的研究甚少，而黃酮類化合物有較強的清除自由基、抗氧化活性作用，具有抗癌、抗病毒、抗過敏、抗發(fā)炎及保護心腦血管等功能。雙水相提取是基于分離物質(zhì)在醇鹽雙水相體系中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離[6-7]，不僅有利于醇回收，分離性能較佳，且成本較低，已被廣泛應(yīng)用于天然小分子化合物的提取分離[8-9]，而輔助超聲提取可有效縮短提取時間，提高產(chǎn)品得率、產(chǎn)品質(zhì)量，減少物化危害[10]。目前，滇黃精總黃酮的提取方法主要有溶劑提取、超聲提取、微波提取、超臨界流體萃取等方法，而基于超聲雙水相提取總黃酮鮮見報道。本試驗擬以滇黃精總黃酮提取率為指標(biāo)，通過單因素及Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化超聲輔助雙水相提取工藝條件，并研究總黃酮對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、超氧陰離子、羥自由基清除能力及小鼠肝組織脂質(zhì)自氧化能力，以期為滇黃精黃酮的藥用、食用及日化產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 試驗材料 無水乙醇、硫酸銨、鐵氰化鉀、無水碳酸鈉等，均為分析純，均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供;蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，由西安匯林生物科技有限公司生產(chǎn);2月齡昆明小鼠（KM小鼠），體質(zhì)量為（28±5） g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 儀器 KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器，由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，由上海上天精密儀器有限公司生產(chǎn);FA1004型電子天平，由上海越平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);UV-2550型紫外-可見分光光度計，由梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)。

1.2 滇黃精總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，用40%乙醇配制成130.0 mg/L蕓香苷儲備液;分別移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蕓香苷儲備液于10 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液各0.5 mL，搖勻，靜置 5 min;加入4%氫氧化鈉溶液3 mL，40%乙醇定容至 10 mL，充分搖勻，靜置;以空白試劑作參比，采用紫外分光光度計測定波長為510 nm下的吸光度;以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、蕓香苷濃度為橫坐標(biāo)（x），得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=0.113 2x-0.001 5（r2=0.999 4）。

1.2.2 滇黃精總黃酮超聲輔助雙水相提取 準(zhǔn)確稱取滇黃精適量，干燥，粉碎，裝入三角燒瓶中，在乙醇-硫酸銨雙水相體系中超聲提取黃精總黃酮，浸提液以3 000 r/min冷凍離心20 min;上清液在60 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑得濃縮液，真空冷凍干燥得黃精總黃酮提取物;測定總黃酮提取率[10-11]，計算公式為

C=m1/m2×100%。

式中：C為總黃酮提取率;m1、m2分別為提取的總黃酮量、滇黃精總質(zhì)量，g。由于乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，硫酸銨在 0.2～0.6 g/mL條件下能形成較穩(wěn)定的雙水相體系[11]，因此本試驗采用40%的乙醇進行提取。

1.2.3 超聲輔助雙水相單因素提取對滇黃精總黃酮提取率的影響 在相應(yīng)固定硫酸銨[（NH4）2SO4]用量為0.4 g/mL、超聲時間為30 min、液料比為30 mL ∶ 1 g中的2個因素保持不變條件下，分別考察液料比為20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1、35 ∶ 1、40 ∶ 1（mL ∶ g），超聲時間為10、20、30、40、50 min，（NH4）2SO4用量為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL對滇黃精總黃酮提取率[12-13]的影響，并確定Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計所需的水平范圍。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選滇黃精總黃酮提取工藝 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗，以滇黃精總黃酮提取率為指標(biāo)優(yōu)化超聲時間、硫酸銨用量、液料比等3個提取工藝參數(shù)，試驗設(shè)計見表1。

1.3 滇黃精總黃酮的抗氧化活性

1.3.1 對DPPH自由基清除能力的測定 以無水乙醇為溶劑，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的滇黃精總黃酮量分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，備用;精密吸取300 μL各濃度溶液，分別加入0.004% DPPH液2 mL，充分混合，室溫下靜置20 min，同時，另精確吸取各溶液300 μL，分別加入無水乙醇2 mL，混合均勻;采用紫外分光光度計分別測定波長為 517 nm 處的吸光度，計算滇黃精總黃酮對DPPH自由基的清除率，公式為

D=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

式中：D為滇黃精總黃酮對DPPH自由基的清除率;D0為不加樣品的DPPH吸光度，空白對照;D1為溶液加DPPH的吸光度;D2為以無水乙醇為對照，溶液加無水乙醇的吸光度。同法測定維生素C溶液（陽性對照）對DPPH自由基的清除能力。

1.3.2 對羥自由基清除能力的測定 取1.5 mL配制好的不同濃度滇黃精總黃酮樣品溶液，分別加入 2.5 mmol/L水楊酸溶液1.0 mL、5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、蒸餾水2.0 mL，搖勻，靜置10 min;加入5 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min;分別測定波長為510 nm處的吸光度，以維生素C溶液作為陽性對照。計算滇黃精總黃酮對羥自由基的清除率，公式為

H=[D0-（D2-D1）]/D0×100%。

式中：H為滇黃精總黃酮對羥自由基的清除率;D0為蒸餾水的吸光度，空白對照;D1為不加H2O2樣品溶液的吸光度;D2為樣品溶液加H2O2的吸光度。

1.3.3 對超氧陰離子自由基清除能力的測定 取 50 mmol/L、pH值為8.12的Tris-HCl緩沖液6.0 mL，分別加入0.5 mL配制好的不同濃度滇黃精總黃酮樣品溶液，混勻，于37 ℃水浴鍋中靜置10 min;加入7 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液1 mL，混勻，靜置5 min，測定波長為510 nm處的吸光度。同法，用蒸餾水代替樣品測定吸光度作為空白對照，以維生素C溶液作為陽性對照。滇黃精總黃酮對超氧陰離子自由基清除率的計算公式如下：

O=（D0-D）/D0×100%。

式中：O為滇黃精總黃酮對超氧陰離子自由基的清除率;D0為僅含鄰苯三酚鹽酸溶液的吸光度，空白對照;D為樣品溶液加入鄰苯三酚鹽酸溶液的吸光度。

1.3.4 對小鼠肝組織自發(fā)性氧化的影響 小鼠肝臟以冰冷的生理鹽水灌注，濾紙拭干，稱質(zhì)量;冰浴條件下，用pH值為7.2的磷酸鹽（PBS）緩沖溶液制成10%組織勻漿;取勻漿 0.5 mL，分別加入不同濃度的滇黃精總黃酮，使總黃酮終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，生理鹽水補充至 1 mL，于37 ℃恒溫振蕩器中孵育1.5 h，測定丙二醛（MDA）含量，計算自發(fā)性氧化抑制率。以維生素C溶液作為陽性對照。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助雙水相單因素提取對滇黃精總黃酮提取率的影響

2.1.1 超聲時間對總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨超聲時間的延長，滇黃精總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)超聲時間為30 min時，滇黃精總黃酮提取率相對最大，為 5.63%，這可能是由于超聲時間促進細(xì)胞壁的破裂，使總黃酮浸出速率和程度提高，但時間過長會使某些黃酮類成分被破壞，致使含量有所下降[15]。因此，選擇20～40 min為響應(yīng)曲面設(shè)計所需的超聲時間范圍。

2.1.2 硫酸銨用量對總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨硫酸銨用量的增加，滇黃精總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)硫酸銨用量為0.4 g/mL時，總黃酮提取率相對最高，為5.56%，這是因為增加硫酸銨用量可能會與乙醇爭奪體系中的水，使滇黃精總黃酮在乙醇相中的含量相對減少，導(dǎo)致提取率下降。因此，選擇0.3～0.5 g/mL為響應(yīng)曲面設(shè)計所需的硫酸銨用量范圍。

2.1.3 液料比對總黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨液料比的增加，滇黃精總黃酮提取率呈先上升后下降再穩(wěn)定在一定水平的趨勢，當(dāng)液料比為25 mL ∶ 1 g時，總黃酮提取率相對最高，為5.75%，這可能是因為提取液的增加可使滇黃精與提取溶劑充分接觸，有利于總黃酮的浸出，當(dāng)液料比超過35 mL ∶ 1 g時，總黃酮基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，選擇（20～30） mL ∶ 1 g為響應(yīng)曲面設(shè)計所需的液料比范圍。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化滇黃精總黃酮微波輔助提取工藝

對黃精總黃酮微波輔助提取的工藝進行Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化試驗，結(jié)果見表2。采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken試驗，對各因素進行擬合，得到多元回歸方程為總黃酮提取率=-13.118+0.547A+14.508B+0.583C+0.148AB+1.250×10-3AC+0.430BC-9.591×10-3A2-39.150B2-0.016C2。對滇黃精總黃酮提取率回歸模型進行方差及顯著性分析，由表3可見，該模型方程回歸性顯著（P<0.000 1），失擬項不顯著（P=0.345 2>0.05），說明在本試驗條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映各提取工藝參數(shù)對總黃酮提取率的影響;判定系數(shù)R2、R2adj分別為0.990 2、0.977 7，說明回歸模型與試驗值擬合度較好，可用于滇黃精總黃酮提取率的理論推測和分析;各因素對滇黃精總黃酮提取率的影響表現(xiàn)為超聲時間>硫酸銨用量>液料比;由F檢驗可知，一次項中超聲時間、硫酸銨用量對總黃酮的提取具有極顯著影響（P<0.01），交互項中硫酸銨用量與液料比對總黃酮的提取具有極顯著影響（P<0.01），超聲時間與硫酸銨用量具有顯著影響（P<0.05），二次項中超聲時間、硫酸銨用量、液料比對總黃酮的提取均具有極顯著影響（P<0.01），其他項作用不顯著（P>0.05），這與3D效應(yīng)面圖（圖4）中反映的各因素間交互作用結(jié)果相吻合。

由Design-Expert 8.0.6軟件得出滇黃精總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為超聲時間32.01 min、硫酸銨用量 0.39 g/mL、液料比為24.32 mL ∶ 1 g，此時總黃酮提取率預(yù)測值為6.06%。為便于生產(chǎn)，確定超聲時間為32 min、硫酸銨用量為0.39 g/mL、液料比為24 mL ∶ 1 g，并進一步驗證得出總黃酮提取率為6.21%，與預(yù)測值比較接近，確定超聲時間32 min、硫酸銨用量0.39 g/mL、液料比24 mL ∶ 1 g為超聲輔助雙水相體系提取黃精總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)。

2.3 滇黃精總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力 DPPH法廣泛用于食品的抗氧化能力和生物樣品定量檢測。由圖5可知，滇黃精總黃酮對DPPH自由基有較強的清除能力，且與使用濃度存在正相關(guān)關(guān)系;當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時，滇黃精總黃酮對DPPH自由基的清除率為86.5%，而等濃度維生素C溶液對DPPH自由基的清除率為83.5%，同濃度的滇黃精總黃酮與維生素C溶液對DPPH自由基的清除能力相互之間差異不明顯。

2.3.2 對超氧陰離子的清除能力 由圖6可知，滇黃精總黃酮對超氧陰離子有較強的清除能力，且隨濃度的增加而有所提高;當(dāng)?shù)狳S精總黃酮濃度為0.5 mg/mL時，滇黃精總黃酮對超氧陰離子的清除能力為88.4%，維生素C溶液的清除能力為87.2%，同濃度的滇黃精總黃酮與維生素C溶液對超氧陰離子的清除能力相互之間差異不明顯。

2.3.3 對羥自由基的清除能力 由圖7可知，滇黃精總黃酮對羥自由基有較強的清除作用，且隨濃度的增加而增強;當(dāng)?shù)狳S精總黃酮濃度為 0.5 mg/mL時，滇黃精總黃酮對羥自由基的清除率為87.3%，維生素C溶液的清除率為88.2%，同濃度的滇黃精總黃酮與維生素C溶液對羥自由基的清除能力相互之間差異不明顯。

2.3.4 對小鼠肝組織自發(fā)性氧化的影響 由圖8可知，滇黃精總黃酮對小鼠肝組織自發(fā)性氧化具有明顯的抑制作用，且隨著總黃酮濃度的增加，抑制作用增強;當(dāng)?shù)狳S精總黃酮濃度為0.5 mg/mL時，滇黃精總黃酮對肝組織自發(fā)性氧化的抑制率為85.3%，維生素C溶液的抑制率為86.8%，同濃度的滇黃精總黃酮與維生素C溶液對小鼠肝組織自發(fā)性氧化的抑制率相互之間差異不明顯。

3 結(jié)論

本試驗以滇黃精為主要原料，采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計對其總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝條件進行優(yōu)化，并研究滇黃精總黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的清除能力及對小鼠肝組織脂質(zhì)自氧化能力。結(jié)果表明，滇黃精總黃酮超聲輔助雙水相提取的最佳工藝條件為超聲時間32 min、硫酸銨用量0.39 g/mL、液料比24 mL ∶ 1 g，在該條件下得出的總黃酮提取率為6.21%;滇黃精總黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基均有較強的清除能力，且能抑制小鼠肝組織脂質(zhì)自氧化能力。超聲雙水相提取滇黃精黃酮工藝穩(wěn)定，獲得的總黃酮有較好的抗氧化能力，這對滇黃精的加工利用及食品、日化、醫(yī)藥等增值化產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的參考作用。

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