雙菌種混合發(fā)酵制備銀瓜酵素的生產(chǎn)工藝研究

張 媛 媛

(濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東 青州 262500)

青州彌河銀瓜表皮潔白、個大、肉脆、味甜、香氣濃郁，更重要的是其含糖量高、且營養(yǎng)豐富。銀瓜含有脂肪酶、多酚氧化酶、蛋白酶等豐富的酶類，每100g瓜中含糖6.75g，其中含蔗糖3.75g、葡萄糖1.25g、果糖 1.75g，含維生素C18.6g，含總酸0.095g，且可溶固形物含量最高可達13%[1]?！妒朝煴静荨分杏杏涊d:銀瓜具生津止渴緩解便秘、利尿、除煩熱、通三焦之功效。

酵素是一類以酵母菌等益生菌為發(fā)酵劑，以果蔬等食材為原料發(fā)酵而成，含有豐富酶類、維生素、礦物質(zhì)及多種生物活性成分的功能性發(fā)酵液體或固體。酵素中含有脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等酶類以及多種維生素、乳酸等物質(zhì)，具有促進正常新陳代謝，增強機體免疫，消炎、抗菌、抗氧化、解酒護肝、美白、抗癌等功效[2]。目前日本、韓國、臺灣等地的酵素產(chǎn)品在國內(nèi)盛行，而我國自產(chǎn)酵素產(chǎn)品品種雖多，但傳統(tǒng)酵素生產(chǎn)周期較長、成本高，絕大多數(shù)酵素食品都依賴于進口，且市場價格昂貴。因此在保證產(chǎn)品質(zhì)量、充分利用資源的基礎(chǔ)上，對其制備方法進行科學(xué)研究具有巨大的潛在價值，也是酵素研究需要迫切開展的課題。

銀瓜營養(yǎng)豐富，但由于青州彌河銀瓜成熟集中，采收時氣溫高，后熟較快，不易長時間貯藏。銀瓜存放時，糖分、氨基酸等營養(yǎng)成分也會快速減少，不利于保存，給瓜農(nóng)造成經(jīng)濟損失。由于銀瓜種植的地域特點等原因，銀瓜酵素國內(nèi)外少見報道，本文采用彌河銀瓜為原料，通過復(fù)合菌種發(fā)酵得到銀瓜酵素原液，再經(jīng)過后序加工制成營養(yǎng)均衡的功能性飲品，既為酵素市場提供了一種營養(yǎng)產(chǎn)品，又解決了青州銀瓜不耐儲存的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料：青州彌河銀瓜；購于青州市彌河銀瓜種植基地；白砂糖市售；市售活性釀酒干酵母(安琪酵母500g/袋)；醋酸菌(為實驗室保藏)。

1.1.2 儀器：紫外/ 可見分光光度計(上海元析儀器有限公司，V-5000型)；酸度計(上海佑科儀器有限公司，數(shù)字酸度計PHS-3C)；糖度計(上海儀電物理光學(xué)WZS系列手持式糖度計)。

1.2 加工方法

挑選新鮮成熟的銀瓜 → 無菌水沖洗→ 切分打漿→加入果膠酶→ 過濾→ 調(diào)節(jié)糖度(12%)→ 滅菌→ 接種混合菌種→ 密封發(fā)酵18天→ 酵素原液

1.3 檢測方法

1.3.1 粗酶液的分離

將發(fā)酵好的酵素原液在4 ℃下5000 r/min離心20 min，取其上清液即為粗酶液。

1.3.2 脂肪酶酶活的測定方法

脂肪酶定義：30 ℃下，1 min內(nèi)產(chǎn)生1μmol油酸所需的脂肪酶量為一個活力單位(U)。

采用黃錫榮等的方法[3]，取兩只50mL 具塞錐形瓶，分別加入50mmol/L AOT 的異辛烷溶液4.5mL、0.5mL三油酸甘油酯，移取 45μL 1.0mg/mL的酶液加入其中的一瓶中(作樣品)，另一只瓶加入45μL 66.7mmol/L磷酸緩沖液(作空白)，將兩只錐形瓶放入30 ℃恒溫振蕩水浴中保溫20min。各從兩瓶中移取0.4mL反應(yīng)液于兩支10mL具塞離心管中，再于離心管中各加入4.6mL苯和1.0mL 5 %的CuAc2吡啶溶液，快速混合以終止酶促反應(yīng)。各取上清液于1cm玻璃比色皿中，以空白為參比，測加酶反應(yīng)液樣品在715nm處的吸光度A。根據(jù)吸光度A值，在油酸工作曲線上用內(nèi)插法計算出油酸含量，再根據(jù)酶活定義算出酶活及比活。

1.3.3 蛋白酶酶活的測定方法

參考國標SB/T10317-1999 《蛋白酶活力測定法》。

蛋白酶酶活定義：40℃1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪蛋白定義為一個蛋白酶活力單位(U)。

1.3.4 超氧化物歧化酶活力測定方法

參考GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性國標測定方法》。

1.3.5 感官評價

以10個人為一組進行感官評價，共三組。在相同的環(huán)境和條件下，對最終銀瓜酵素的感官指標進行打分。感官指標包括酵素的色澤、氣味以及口感，其中口味口感占45%，色澤占30%，氣味占25%，總分為100分。三類分數(shù)綜合相加之后，總分取平均分。分數(shù)分為四個等級，80～100分為質(zhì)量優(yōu)的，質(zhì)量良好的70～79分、60～69分為可以接受的，低于60分為質(zhì)量差的。

1.3.6 酵母菌、醋酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

本試驗采組合試驗設(shè)計，根據(jù)酵母菌及醋酸菌的接種量為因素試驗結(jié)果分析確定因素水平，以蛋白酶酶活、脂肪酶酶活為響應(yīng)值，試驗以隨機次序進行，重復(fù)三次，分析優(yōu)化乳酸菌、酵母菌發(fā)酵條件。

表1 酵母菌和醋酸菌添加量

1.4 菌種的活化

酵母菌的活化：將活性干酵母加入到2%的葡萄糖中，在30 ℃的條件下活化3～5h，然后按比例加入發(fā)酵液。

醋酸菌的活化：活化菌種在MRS液體培養(yǎng)基中進行，32 ℃培養(yǎng)箱中傳代2～3次，使菌種數(shù)量達到109CFU/mL，然后按比例加入發(fā)酵液。

酵母菌計數(shù)采用血球計數(shù)板法。醋酸菌菌落數(shù)根據(jù)平板計數(shù)法，參照國標GB4789.2-2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》。

2 結(jié)果與討論

蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶是酵素產(chǎn)品的重要功效酶，通過表2中測定結(jié)果可以看出，酵母菌和醋酸菌的添加比例及接種量對酵素中脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶的活力影響顯著。

2.1 接種量對脂肪酶活力的影響

脂肪酶是一類水解油脂的酶，可以水解天然的油脂，酵素產(chǎn)品的減肥作用正是源于此酶的功能，結(jié)果表明當(dāng)酵母菌添加量7.5%，醋酸菌添加量5%，總接種量為12.5%時，脂肪酶的活力最高(見表1、表2)。

2.2 接種量對蛋白酶活力的影響

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的酶，在體內(nèi)能幫助人體消化食物中的一些大分子的蛋白質(zhì)，結(jié)果表明當(dāng)酵母菌添加量7.5%，醋酸菌添加量5%，總接種量為12.5%時，蛋白酶的活力最高(見表1、表2)。

2.3 接種量對超氧化物歧化酶活力的影響

超氧化物歧化酶可以幫助機體清除超氧陰離子自由基，具有抗氧化防衰老等功效，結(jié)果表明在酵母菌添加量10%，醋酸菌添加量5%時，總接種量為15%，超氧化物歧化酶的活力最高(見表1、表2)。

綜上結(jié)果分析，酵母菌含有豐富的酶類，隨著酵母菌的添加比例的提高脂肪酶和蛋白酶活力有顯著提高，超氧化物歧化酶的活力在酵母菌添加量為10%，醋酸菌接種量5%時，活力最高，但在酵母添加量為10%，醋酸菌添加量為5%時，由于總接種量過大，不利于菌種的繁殖和生長，會引起酵素的脂肪酶和蛋白酶活力相對低些，超氧化物歧化酶則受到的影響較小(見表1、表2)。

表2 脂肪酶、蛋白酶與超氧化物歧化酶活力變化U

2.4 感官評價

通過感官評價結(jié)果可以看出，本文采取的發(fā)酵工藝使銀瓜酵素在口味上得到了很大的改善。在酵母菌添加量7.5%，醋酸菌添加量5%，總接種量為12.5%時，酵素感官評價分數(shù)最高(見表1、表3)。

表3 不同接種比例的銀瓜酵素感官對比(平均分)

分析原因，醋酸菌接種比例過大，會引起酵素的氣味較沖，且口感酸澀殺口，適當(dāng)?shù)奶岣呓湍傅谋壤梢宰尳退厣珴赏噶?，氣味帶有銀瓜的芳香，且口感酸度適宜。

3 小結(jié)

本研究設(shè)計了一種銀瓜酵素的制作工藝，綜合考評最終酵素的脂肪酶、蛋白酶及超氧化物歧化酶的活性，在最大程度滿足目標的條件下確定發(fā)酵菌種比例為：酵母菌7.5%，醋酸菌添加量5%，總接種量為12.5%，感官評價評分為86.82。

目前國內(nèi)一般酵素的制作工藝，大多是把多種蔬菜水果處理后進行自然發(fā)酵成蔬果酵素原液，這樣的傳統(tǒng)工藝很難控制酵素的質(zhì)量和發(fā)酵時間，且其中的菌種種類多、復(fù)雜，而本研究利用酵母菌和醋酸菌的互利共生關(guān)系，使酵素朝著我們預(yù)期的方向發(fā)展，雙菌種混合發(fā)酵生產(chǎn)的酵素營養(yǎng)價值得到大幅度提升。雙菌種混合發(fā)酵既可以最大程度的保留銀瓜原有的豐富營養(yǎng)，還能產(chǎn)生多種活性酶等有益成分，下一步工作將繼續(xù)研究酵素產(chǎn)品的調(diào)配方式，生產(chǎn)出營養(yǎng)口味符合大眾要求的酵素產(chǎn)品。此外，還要對銀瓜酵素的生產(chǎn)工藝條件進行優(yōu)化， 確定銀瓜酵素的工業(yè)化生產(chǎn)工藝參數(shù)，生產(chǎn)出質(zhì)優(yōu)味美的銀瓜酵素，使之成為極具特色的酵素產(chǎn)品，更好地服務(wù)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟建設(shè)。