草果胚培養(yǎng)技術(shù)研究

胡 彥，張 鐵，張志信，楊緒旺，胡展育

（1.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2.文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

草果（Amomum tsao-ko）是姜科豆蔻屬多年生植物，生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶蔭蔽潮濕的闊葉林中，主要分布于中國(guó)云南、廣西、貴州等地。草果果實(shí)是傳統(tǒng)的中藥材和調(diào)味品。草果具有特殊濃郁的辛辣香味，是一種很好的調(diào)味香料；此外，具有燥濕溫中、截瘧祛痰、瘟疫發(fā)熱、消食化亂之功效；可以治療寒濕內(nèi)阻，脘腹脹痛，痞滿嘔吐，瘧疾寒熱，瘟疫發(fā)熱等病癥[1]。草果中的揮發(fā)油，含有幾十種化學(xué)成分，其中的桉油精、香葉醇、檸檬醛等化學(xué)成分，具有抗真菌、細(xì)菌[2-3]，抗癌[4]、清除DPPH自由基的作用[5]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和香料工業(yè)[6]。云南是我國(guó)草果的主要產(chǎn)地，文山州馬關(guān)縣有“中國(guó)草果之鄉(xiāng)”的稱(chēng)號(hào)，但在栽培上缺乏優(yōu)良品種，草果產(chǎn)量不高。草果繁殖的方法，一是采用播種繁殖[7]，二是分株繁殖[8]，蕭洪東等[9]以草果側(cè)芽為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的方法已經(jīng)有報(bào)道，但筆者經(jīng)過(guò)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其污染率極高，而有關(guān)草果胚培養(yǎng)未見(jiàn)報(bào)道。本研究以草果的胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)草果無(wú)菌苗，取草果無(wú)菌苗莖段進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，然后進(jìn)行生根培養(yǎng)，以期取得最佳培養(yǎng)基配方，建立草果無(wú)性快繁體系，為云南省各地區(qū)規(guī)?；a(chǎn)草果優(yōu)良的種苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取充分成熟的草果種子胚作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

按配方配制實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基，分裝入培養(yǎng)瓶后經(jīng)高壓濕熱（壓力0.12 MPa、溫度121 ℃）滅菌25 min，備用。

1.2.2 胚培養(yǎng)

選取充分成熟的草果果實(shí)，先用洗潔精將草果清洗干凈，然后放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，在無(wú)菌燒杯中用75%酒精浸泡10 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡15 min后，以無(wú)菌水洗3次，然后取出草果種子，放入滅菌后的燒杯中，按上述草果果實(shí)的消毒方法，再對(duì)草果種子進(jìn)行消毒。在無(wú)菌條件下，用解剖刀剝?nèi)〔莨?，接種于下列培養(yǎng)基中：（1）MS+1.0 mg·L-12，4-D；（2）MS+1.0 mg·L-1NAA；（3）MS+1.0 mg·L-1IAA。每種培養(yǎng)基配制20瓶，每瓶培養(yǎng)基中接種2～3粒草果胚。先在25 ℃下進(jìn)行暗培養(yǎng)20 d，當(dāng)胚萌發(fā)產(chǎn)生愈傷組織膨大后，轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 600～2 100 lx，溫度（25±2）℃，濕度控制在65%～75%，光照12 h·d-1。每10 d觀察1次草果胚生長(zhǎng)情況，光照培養(yǎng)總時(shí)間約30 d，胚直接發(fā)育形成無(wú)菌苗。計(jì)算成苗率，成苗率（%）＝草果的苗數(shù)／接種的胚數(shù)×100。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究草果不定芽的增殖培養(yǎng)

在查閱前人試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[9]，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選草果不定芽增殖培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。取以胚為外植體培養(yǎng)的草果無(wú)菌苗，在無(wú)菌條件下切成帶1～2個(gè)節(jié)間的莖段，插入9種不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，每瓶插入1～2個(gè)莖段。培養(yǎng)條件為：溫度為25 ℃，光照時(shí)間15 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx；濕度為75%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平

誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后，觀察記錄已萌發(fā)的外植體（草果莖段）的數(shù)量，計(jì)算萌發(fā)率。萌發(fā)率=已萌發(fā)的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)。增殖培養(yǎng)前及接種培養(yǎng)30 d后，分別記錄每一芽叢的芽數(shù)，計(jì)算增殖芽數(shù)。

增殖芽數(shù)=培養(yǎng)后芽數(shù)-培養(yǎng)前的芽數(shù)

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳不定芽增值培養(yǎng)基配比，再將最佳試驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，檢驗(yàn)該培養(yǎng)基在誘導(dǎo)草果不定芽培養(yǎng)時(shí)的可靠性。

1.2.5 生根培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上切取健壯的經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)的草果不定芽，分別接種于以下生根培養(yǎng)基中：（1）MS+0.2 mg·L-1IBA；（2）MS+0.2 mg·L-1NAA；（3）MS+0.1 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA。觀察不同培養(yǎng)基對(duì)草果生根率和根生長(zhǎng)情況的影響。以上每種生根培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種1～2 株不定芽。

培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，溫度（25±2）℃，濕度控制在60%～75%，光照12 h·d-1。培養(yǎng)時(shí)間約30 d，每10 d觀察1次草果不定芽生根生長(zhǎng)情況。計(jì)算生根率，生根率（%）＝生根的不定芽數(shù)／接種的不定芽數(shù)×100。

1.2.6 煉苗移栽

草果不定芽生根培養(yǎng)30 d后，轉(zhuǎn)移到蔭棚中煉苗，煉苗時(shí)間12 d，煉苗結(jié)束后，取出小苗，用清水洗凈附著在根系上的培養(yǎng)基，然后栽植在營(yíng)養(yǎng)杯中（營(yíng)養(yǎng)土由消毒過(guò)的腐葉土和菜園土（3∶1）混合配成），置于蔭棚下，按常規(guī)育苗技術(shù)進(jìn)行水肥管理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚培養(yǎng)

由草果種子中取出的胚，分別接種于含有2，4-D、NAA、IAA各1.0 mg·L-1的 MS培養(yǎng)基上，先進(jìn)行暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)，50 d后，統(tǒng)計(jì)成苗率，其結(jié)果如下：1.0 mg 2，4-D對(duì)誘導(dǎo)胚成苗效果最好，為76.5%、1.0 mg NAA誘導(dǎo)胚成苗率65.3%、1.0 mg IAA誘導(dǎo)成苗率62.6%。（見(jiàn)圖1：1，圖1：2）

2.2 正交實(shí)驗(yàn)不同激素及濃度對(duì)草果不定芽增殖培養(yǎng)的影響

由表2可知，處理5，即在添加2.0 mg·L-16-BA，1.5 mg·L-1NAA 和1.0 mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基上，草果莖段不定芽萌發(fā)率最高，達(dá)到了89%；極差分析得出，影響草果不定芽分化的主次因素為A＞C＞B，即 6-BA＞2，4-D＞NAA；草果不定芽誘導(dǎo)的最優(yōu)方案為A2B2C3，即MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D（見(jiàn)圖1：3）。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，6-BA對(duì)草果莖段不定芽萌發(fā)率的誘導(dǎo)在0.01水平下顯著；NAA，2，4-D對(duì)草果莖段不定芽萌發(fā)率的誘導(dǎo)在0.05水平下均不顯著，這與極差分析方法結(jié)果一致。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確地在MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-16-BA ，1.5 mg·L-1NAA 和 1.0 mg·L-12，4-D進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。其草果莖段不定芽萌發(fā)率為90%，芽粗壯，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，不定芽萌發(fā)率高，該培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)增殖培養(yǎng)階段的平均增殖率為2.5，尚需進(jìn)一步研究以提高增殖率。

2.4 生根培養(yǎng)

采用三種不同的培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)草果不定芽生根，處理（3），即在添加 0.1 mg·L-1IAA，0.1 mg·L-1NAA 和 1.0 mg·L-1IBA的MS培養(yǎng)基上，不定芽生根率最高，達(dá)到97%，并且芽苗生根較好，根較多且粗，其次為處理（2），即在添加0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，生根率88%，生根率最低的是處理（1），即在添加0.2 mg·L-1IBA的MS培養(yǎng)基上，生根率為82%。（見(jiàn)圖1：4）

2.5 煉苗移栽及成活率

煉苗移栽后，試管苗恢復(fù)生長(zhǎng)較快，植株較均勻整齊，試管苗成活率100%。

圖1 草果胚培養(yǎng)無(wú)性快繁技術(shù)生長(zhǎng)過(guò)程圖片

3 討論與結(jié)論

筆者曾經(jīng)采用草果的側(cè)芽（筍芽）為外植體，開(kāi)展草果優(yōu)良品種組培快繁研究，但由于草果帶菌多，采用多種方法均未解決污染問(wèn)題（真菌及細(xì)菌污染），導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。本研究以草果種子的胚為外植體，分別對(duì)其進(jìn)行胚培養(yǎng)、不定芽增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并篩選出了最佳培養(yǎng)基配方。（1）胚培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+1.0 mg·L-12，4-D；（2）不定芽增殖培養(yǎng)基：MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D；（3）生根培養(yǎng)基：MS+0.1 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA。本實(shí)驗(yàn)增殖培養(yǎng)階段的平均增殖率約為2.5，需進(jìn)一步研究以提高增殖率。

對(duì)于組織培養(yǎng)，外植體的消毒是比較困難的環(huán)節(jié)，所以外植體的選擇非常關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用草果種子胚作為外植體，在消毒過(guò)程中首先對(duì)草果果實(shí)消毒，然后對(duì)種子的種皮消毒，并未傷害到種子里面的胚，避免了消毒劑對(duì)外植體的毒害，接種成活率高。

草果為多年生常綠叢生草本經(jīng)濟(jì)植物，其果實(shí)既可作為中藥材，也可作為調(diào)味香料用于菜肴烹飪，一般草果種植3～4年后即可開(kāi)花結(jié)果，可連續(xù)結(jié)果20年以上。種植草果是山區(qū)農(nóng)民增收的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源，是脫貧致富的一條重要途徑[10]。草果種子胚培養(yǎng)無(wú)性快繁技術(shù)體系的建立，可為云南省各地區(qū)規(guī)?；a(chǎn)草果優(yōu)良品種種苗提供技術(shù)支持。