紅鰭東方鲀精原干細(xì)胞鑒定、分離及純化

任玉芹 周 勤 孫朝徽 宋立民 于清海 姜秀鳳 王玉芬 王青林

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，秦皇島 066100)

紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)因其味鮮肉嫩,營養(yǎng)價值高, 是我國北方海水魚養(yǎng)殖的主要種類之一[1]。相比紅鰭東方鲀魚肉, 俗稱“白子”的雄魚精巢更是被人們視為珍品。由于養(yǎng)殖市場對雄魚苗種的需求, 科研工作者開始重視對其性別選擇育種尤其全雄化技術(shù)[2—6]。近十年來, 激素誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)化在單性魚制備中是一個十分有效并廣泛采用的技術(shù)[7]。本課題組已經(jīng)通過17-β雌二醇成功誘導(dǎo)出偽雌魚, 待其性成熟后與天然雄魚人工授精, 獲得全雄苗種的父本來源——“YY”超雄魚, 最終實(shí)現(xiàn)全雄苗種規(guī)?；a(chǎn)。但是紅鰭東方鲀需要3年才能達(dá)到性成熟, 而且親魚個體較大(體重2—5 kg), 需要大量的時間和空間來保存親魚。因此通過激素誘導(dǎo)最終獲得全雄苗種的選擇育種技術(shù)存在養(yǎng)殖成本高的問題。

近年來, 生殖細(xì)胞移植技術(shù)(Germ cell transplantation, GCT)在各種魚類中廣泛應(yīng)用[7—13], 均獲得了源自供體的功能配子或后代。一般地進(jìn)行生殖干細(xì)胞移植多采用的細(xì)胞是原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells, PGCs)、精原細(xì)胞(Spermatogonial, SG)和卵原細(xì)胞(Oogonia, OG)[14]。精原細(xì)胞包括A型精原細(xì)胞、中間型精原細(xì)胞和B型精原細(xì)胞[15], 而進(jìn)行細(xì)胞移植的主要是A型精原干細(xì)胞, 即精原干細(xì)胞(Spermatogonial Stem Cells, SSCs)。與PGCs相比, SSCs不僅同樣具有自我更新、多能性的干細(xì)胞特點(diǎn)和分化并發(fā)育為雌雄配子的潛力[16],而且還具有細(xì)胞量大, 分離方法簡易等優(yōu)點(diǎn)。Okutsu等[17]利用SSCs移植技術(shù)路線制備出了虹鱒YY“超雄魚”并最終生產(chǎn)了全雄虹鱒苗種。星點(diǎn)東方鲀與紅鰭東方鲀同屬東方鲀屬, 其性成熟時間短(10個月左右)、個體較小(10—15 cm)是紅鰭東方鲀的理想受體。以紅鰭東方鲀精原干細(xì)胞為供體,選擇星點(diǎn)東方鲀雌魚為受體, 利用精原細(xì)胞的性別可塑性, 可以獲得攜帶Y染色體的卵子, 這將降低紅鰭東方鲀親魚養(yǎng)殖成本, 而且也大大加速紅鰭東方鲀的選擇育種工作, 縮短實(shí)現(xiàn)全雄苗種規(guī)?；a(chǎn)的周期。

本文進(jìn)行的工作為紅鰭東方鲀精原干細(xì)胞成功移植技術(shù)不可或缺的一步, 擬開展紅鰭東方鲀精原干細(xì)胞鑒定、分離并比較不同發(fā)育期精原干細(xì)胞量以及精原干細(xì)胞純化研究, 力求獲得比例相對較高的供體精原細(xì)胞懸液, 旨在為紅鰭東方鲀精原干細(xì)胞移植成功提供部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)用魚采自河北省唐山市天河水產(chǎn)有限公司。2018年1月11日隨機(jī)采集22月齡魚3尾, 2018年6月21日隨機(jī)采集14月齡4尾。實(shí)驗(yàn)魚實(shí)驗(yàn)前養(yǎng)殖于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站。在實(shí)驗(yàn)時, 對紅鰭東方鲀雄魚樣品進(jìn)行體長、體重?cái)?shù)據(jù)采集, 然后剪鰓放血。解剖取出性腺, 稱重, 統(tǒng)計(jì)各月齡雄魚生長情況(表 1)。

表 1 各月齡生長情況Tab. 1 The body weight and length at different age

1.2 精巢細(xì)胞懸液制備

對各月齡雄魚統(tǒng)計(jì)生長情況后采集性腺樣, 用4%多聚甲醛保存?zhèn)溆?。每個月齡實(shí)驗(yàn)魚做4個重復(fù)。各月齡雄魚性腺樣品分別稱取300 mg左右精巢組織放入含有L-15培養(yǎng)基的凹面皿中, 剝離精巢薄膜、剪碎組織。參考Takeuchi等[18]酶消化法, 按照100 mg組織加入1 mL酶消化工作液, 每隔0.5h吹打1次。酶消化工作液包括: 0.25% 胰蛋白酶(Worthington公司, LS004454), 0.05% DNA酶Ⅰ(Sigma公司, 11284932001), 5% 胎牛血清(Gibco公司, 16000-044), 溶劑為L-15。在25℃下消化3h后, 依次過濾孔徑100 μm、40 μm細(xì)胞篩網(wǎng), 300×g離心5min, 清洗2次, 最終調(diào)整細(xì)胞濃度, 將細(xì)胞懸浮于含有5%胎牛血清L-15培養(yǎng)基中, 并用臺盼藍(lán)染色, 鑒定細(xì)胞活性, 計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量。并將各月齡抽取1個重復(fù)的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞涂片, 4%多聚甲醛固定備用。

1.3 Percoll密度梯度純化

每個月齡實(shí)驗(yàn)魚做3個重復(fù)。參考張曉麗等[19]對細(xì)胞懸液進(jìn)行非連續(xù)Percoll密度梯度離心純化精原干細(xì)胞。先按照1.5 mol/L NaCl∶Percoll=1∶9比例將Percoll原液配制成生理滲透壓, 然后用生理鹽水將已達(dá)到生理滲透壓的Percoll液配制成10%、30%和50%濃度梯度(Percoll純化參數(shù)已經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化), 制備Percoll梯度液, 將待分離的細(xì)胞懸液置于梯度最上層, 800×g離心30min后, 將各細(xì)胞帶小心移出, 清洗2次, 濃縮至不同的容積, 吹打均勻, 取10 μL臺盼藍(lán)染色, 計(jì)算活細(xì)胞量和A型精原細(xì)胞占比, 在熒光顯微鏡下拍照。將余下的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞涂片, 4%多聚甲醛固定備用。

1.4 組織學(xué)及免疫熒光分析

對性腺組織樣進(jìn)行常規(guī)石蠟連續(xù)切片, 切片厚度5 μm。部分切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色, 中性樹膠封片, Leica (BM 4000)光學(xué)顯微鏡鏡檢并拍照。部分切片進(jìn)行免疫熒光分析。切片脫蠟復(fù)水,抗原修復(fù), 3%過氧化氫溶液室溫孵育25min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶, BSA封閉, 加入一抗∶斑馬魚Vasa兔多克隆抗體(Abcam, ab209710, 1∶100) 4℃孵育過夜, 第2天洗滌甩干切片加入羊抗兔熒光二抗(谷歌生物, GB21303, 1∶300, 陽性紅光), DAPI染液(谷歌生物, G1012, 1∶500)復(fù)染細(xì)胞核, 最后脫水封片, 全組織切片掃描觀察。細(xì)胞涂片免疫熒光分析,需先加入100 μL破膜液(谷歌生物, G1204), 室溫孵育10min進(jìn)行細(xì)胞破膜, 然后按照上述切片免疫熒光步驟, 加一抗、二抗、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、封片、掃描觀察。同一樣本做陰性對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

對14月齡和22月齡2組性腺提取精原干細(xì)胞量和占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn), 是否存在顯著性差異。分別對純化前后不同月齡的細(xì)胞存活率、精原干細(xì)胞量、精原干細(xì)胞占比進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較, 查看各細(xì)胞懸液中A型精原干細(xì)胞量、占比是否存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 精原干細(xì)胞鑒定分析

通過各級生殖細(xì)胞形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)很容易將精原細(xì)胞與精母細(xì)胞、精細(xì)胞分離開。而不同世代的精原細(xì)胞主要依靠細(xì)胞或者細(xì)胞核大小和精小囊內(nèi)生殖細(xì)胞數(shù)目(斑馬魚Danio rerio、虹鱒Oncorhynchus mykiss)進(jìn)行劃分[20,21]。精原干細(xì)胞主要是指A型精原干細(xì)胞。A型精原干細(xì)胞是精巢中最大的生殖細(xì)胞, 細(xì)胞核膜呈不規(guī)則或者圓形, 顯著大于周圍的細(xì)胞; 細(xì)胞核直徑約為8.5—9.7 μm, 有1—2個致密核仁, 核質(zhì)比高于精巢中其他生殖細(xì)胞,且精小囊內(nèi)生殖細(xì)胞數(shù)為1個。A型分化精原細(xì)胞比A型精原細(xì)胞小, 細(xì)胞核直徑約為5.5—7 μm, 核仁靠近細(xì)胞邊緣位置, 且精小囊內(nèi)生殖細(xì)胞數(shù)成組出現(xiàn)(2、4和8); B型精原細(xì)胞遠(yuǎn)小于A型精原細(xì)胞,呈瘦長型或者圓形, 細(xì)胞直徑約為4.8—6 μm, 細(xì)胞核直徑約為4.5—5.5 μm, 有1—2個較小核仁, 且染色質(zhì)較后期A型精原細(xì)胞增多(細(xì)胞核邊緣斑點(diǎn)增多), 精小囊內(nèi)細(xì)胞數(shù)為14—200個(圖 1、圖 2)。通過對14月齡和22月齡的紅鰭東方鲀性腺組織學(xué)連續(xù)切片分析發(fā)現(xiàn): 14月齡雄性精巢中的生殖細(xì)胞大部分為精原細(xì)胞, 以A型精原干細(xì)胞為主, B型精原細(xì)胞次之(圖 1A)。而22月齡精巢處在Ⅲ期末、Ⅳ期初, 此時精巢中存在A型精原干細(xì)胞、B型精原細(xì)胞、精母細(xì)胞等各級生殖細(xì)胞(圖 1D)。

隨著基因組時代的到來, 有關(guān)調(diào)控魚類生殖細(xì)胞的發(fā)育的基因研究也取得一定的進(jìn)展。目前, 在魚類中鑒定分析生殖細(xì)胞的標(biāo)記基因日益增多, 包括oct4、vasa、nanos、dnd和dazl等。其中,vasa基因是DEAD-box家族成員之一, 其產(chǎn)物為DEAD盒RNA螺旋酶, 參與生殖質(zhì)的聚合, PGC的形成及遷移以及核周質(zhì)蛋白的形成等。Vasa蛋白在多數(shù)硬骨魚的PGC、卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞、精原細(xì)胞表達(dá)量高。隨著減數(shù)分裂的進(jìn)行, 一些魚類減數(shù)后期生殖細(xì)胞(如次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞及成熟的卵)中表達(dá)不明顯或未發(fā)現(xiàn)表達(dá)[22]。紅鰭東方鲀雄性精巢組織免疫熒光分析發(fā)現(xiàn):vasa基因在精原細(xì)胞表達(dá), 在精母細(xì)胞中弱表達(dá)(圖 1、圖 2), 跟斑馬魚、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Gunther)等硬骨魚類Vasa蛋白表達(dá)相似[20,23]。根據(jù)各級生殖細(xì)胞形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)以及Vasa蛋白在精原細(xì)胞中呈現(xiàn)的熒光信號強(qiáng)于精母細(xì)胞, 將精原細(xì)胞與體細(xì)胞和精母細(xì)胞區(qū)分開, 最終根據(jù)A型精原干細(xì)胞形態(tài)大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及精小囊內(nèi)生殖細(xì)胞數(shù)目鑒別出精原干細(xì)胞。

圖 1 不同月齡雄魚精巢組織切片及Vasa蛋白在精巢中的定位Fig. 1 Histological sections of gonad at different agesA.14月齡雄魚精巢組織切片; B.14月齡雄魚Vasa蛋白在精巢中的定位; C. 14月齡雄魚組織免疫熒光陰性對照; D. 22月齡雄魚精巢組織切片; E. 22月齡雄魚Vasa蛋白在精巢中的定位; F. 22月齡雄魚組織免疫熒光陰性對照; A-SSC. A型精原干細(xì)胞; B-SG. B型精原細(xì)胞; PS. 初級精母細(xì)胞; SS. 次級精母細(xì)胞; SC. 精細(xì)胞; S. 精子A. The testis histology of 14-month-old fish; B. Immunolocalization of Vasa protein in the testis of 14-month-old fish; C. Tissue immunofluorescence negative control of 14-month-old male fish; D. The testis histology of 22-month-old fish; E. Immunolocalization of Vasa protein in the testis of 22-month-old fish; F. Tissue immunofluorescence negative control of 22-month-old male fish; A-SSC. type A spermatogonial stem cell; B-SG. type B spermatogonia; PS. primary spermatocyte; SS. secondary spermatocyte; SC. sperm cell; S. sperm

2.2 精原干細(xì)胞分離結(jié)果分析

經(jīng)過組合酶消化處理、過濾和清洗, 最終得到不同月齡的紅鰭東方鲀精巢單細(xì)胞懸液。2個月齡的細(xì)胞存活率均高達(dá)90%以上, 且兩者之間不存在顯著性差異(P＞0.05)。通過普通光學(xué)觀察和Vasa蛋白在生殖細(xì)胞中的免疫熒光定位(圖 3), 分析比較14月齡和22月齡精原干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)(表 2): 紅鰭東方鲀14月齡精原干細(xì)胞占比為(72.12±9.39)%, 顯著高于22月齡(P＜0.05); 然而22月齡平均每毫克精巢組織所含精原干細(xì)胞量為(10.89±3.29)×104, 顯著性高于14月齡(P＜0.05); 14月齡和22月齡的性腺指數(shù)之間存在顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 精原干細(xì)胞純化結(jié)果分析

通過Percoll密度梯度離心純化后, 不同濃度的Percoll梯度液將精巢細(xì)胞懸液從上到下分為1、2、3三層, 將各細(xì)胞帶小心吸出清洗2次, 進(jìn)行普通光學(xué)觀察和細(xì)胞免疫熒光分析(圖 4)發(fā)現(xiàn): 1細(xì)胞帶主要為A型精原細(xì)胞和B型精原細(xì)胞(圖 4A、4D)2細(xì)胞帶主要為精母細(xì)胞和B型精原細(xì)胞及少量的A型精原細(xì)胞(圖 4B、4E), 3細(xì)胞帶為血細(xì)胞、精細(xì)胞及精子(圖 4C、4F)。14月齡雄魚精巢生殖細(xì)胞主要分布在1層, 而22月齡雄魚精巢生殖細(xì)胞分布于1、2、3三層。由表 3可知, 14月齡和22月齡純化后存活率較純化前降低, 但與純化前差異不顯著(P＞0.05)。14月齡1細(xì)胞帶精原干細(xì)胞占比遠(yuǎn)高于其他組別(P＜0.05)。2個月齡平均每毫克精巢組織獲得的精原干細(xì)胞量均顯著地低于純化前同一月齡(P＜0.05), 且純化后22月齡顯著高于純化后14月齡(P＜0.05)。

圖 2 精小囊內(nèi)不同級別生殖細(xì)胞特征觀察Fig. 2 The characteristics of germ cells in cystsA、B. 精小囊內(nèi)各種A型精原細(xì)胞特征觀察; C、D. 精小囊內(nèi)B型精原細(xì)胞特征觀察; E、F. 精小囊內(nèi)精母細(xì)胞特征觀察; A-SSC. A型精原干細(xì)胞; Adiff. A型分化精原細(xì)胞A, B. The characteristics of A-type spermatogonia in cysts; C, D. The characteristics of B-type spermatogonia in cysts; E, F. The characteristics of spermatocyte in cysts; A-SSC. type A spermatogonial stem cell; Adiff. type A differentiated spermatogonia

圖 3 細(xì)胞普通光學(xué)觀察及Vasa蛋白在雄性生殖細(xì)胞中的免疫熒光定位Fig. 3 Histology and immunolocalization of Vasa protein in the germ cells of malesA. 細(xì)胞普通光學(xué)觀察; B. Vasa蛋白在雄性生殖細(xì)胞中的免疫熒光定位; A-SSC. A型精原干細(xì)胞; B-SG. B型精原細(xì)胞; PS. 初級精母細(xì)胞; SS. 次級精母細(xì)胞; SC. 精細(xì)胞; S. 精子; BC. 血細(xì)胞A. The histology of cells; B. The immunolocalization of Vasa in the germ cells of males; A-SSC. type A spermatogonial stem cell; B-SG.type B spermatogonia; PS. primary spermatocyte; SS. secondary spermatocyte; SC. sperm cell; S. sperm; BC. Blood cells

3 討論

魚類精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)起源于原始生殖細(xì)胞PGCs, PGCs在胚胎發(fā)育過程中遷移到性腺原基形成性原細(xì)胞, 性原細(xì)胞再發(fā)育成單個A型未分化精原細(xì)胞(type A undifferentiated spermatogonia, Aund)。隨著性腺發(fā)育, Aund進(jìn)行自我更新和分裂形成分化的A型精原細(xì)胞(type A differentiated spermatogonia, Adiff)。Adiff經(jīng)過數(shù)次分裂逐步形成B型精原細(xì)胞, B型精原細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂和減數(shù)分裂最終形成精子[15,24,25]。普遍認(rèn)為Aund才具有干細(xì)胞特性[15,20]。因此, 本文將A型未分化的精原細(xì)胞算作紅鰭東方鲀的精原干細(xì)胞。

魚類精原干細(xì)胞常采用的鑒定方法包括形態(tài)學(xué)鑒定和標(biāo)記基因鑒定。紅鰭東方鲀精原干細(xì)胞形態(tài)特征同其他硬骨魚類相似, 細(xì)胞的直徑為7.3—13.3 μm, 細(xì)胞核直徑為6—9.7 μm, 有1—2個致密核仁, 是精巢中最大的細(xì)胞(圖 1)。vasa基因?qū)儆贏TP依賴的RNA解旋酶中DEAD-box家族, 是魚類生殖細(xì)胞的第一個標(biāo)記基因。斑馬魚vasa基因的分離鑒定為魚類生殖細(xì)胞研究開創(chuàng)了新紀(jì)元, 即應(yīng)用分子生物技術(shù)研究生殖細(xì)胞時代[26]。Vasa蛋白序列在物種進(jìn)化中高度保守, 因此可以通過免疫組化的方法用同一個Vasa抗體來檢測許多不同物種的Vasa蛋白的表達(dá)情況[27]。本文采用的斑馬魚抗體相對的抗原位點(diǎn)與紅鰭東方鲀相應(yīng)的抗原位點(diǎn)同源率為79%, 且通過對紅鰭東方鲀性腺組織westernblot實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證了斑馬魚Vasa抗體對紅鰭東方鲀性腺Vasa抗原位點(diǎn)特異性。因此, 本文采用斑馬魚Vasa抗體檢測紅鰭東方鲀精巢生殖細(xì)胞的Vasa蛋白表達(dá)情況。通過對紅鰭東方鲀精巢組織以及精巢組織分離后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測和比對細(xì)胞核的大小, 鑒別出精原干細(xì)胞。

表 2 14月齡和22月齡精原干細(xì)胞分離結(jié)果Tab. 2 Separation of SSCs at 14-months and 22-months old

圖 4 精原干細(xì)胞純化結(jié)果Fig. 4 Enrichment of SSCsA-C. 純化后各層細(xì)胞帶普通光學(xué)觀察; E-H. Vasa蛋白在生殖細(xì)胞中的免疫熒光定位; 白色箭頭指向A型精原細(xì)胞A-C. Histological observation of each cell zone; E-F. Immunolocalization of Vasa protein in germ cells; The white arrow points to SSCs

如何獲得高比例的精原干細(xì)胞, 有2個關(guān)鍵要素。其中一個關(guān)鍵因素是獲得良好的單細(xì)胞懸液。分離出良好的單細(xì)胞懸液跟選擇的紅鰭東方鲀月齡和酶消化程序息息相關(guān)。隨著性腺發(fā)育,SSCs逐步分化各級生殖細(xì)胞, SSCs的數(shù)量和所占比例都會越來越少, SSCs分離純化變得比較困難[28]。本文通過對生殖季節(jié)前后雄性精巢組織切片觀察發(fā)現(xiàn): 14月齡雄魚精巢處在Ⅱ期初, 以A型精原細(xì)胞為主; 22月齡精巢發(fā)育至Ⅳ初, 出現(xiàn)了少量的精子。理論上, 選擇14月齡進(jìn)行精原干細(xì)胞分離, 可獲得比22月齡相對較高精原干細(xì)胞占比和較高的每毫克精巢組織獲得的精原干細(xì)胞量。本課題組通過比較分析2個月齡成魚精原干細(xì)胞量以及占比發(fā)現(xiàn), 14月齡精原干細(xì)胞占比遠(yuǎn)高于22月齡精原干細(xì)胞占比, 與理論一致。而紅鰭東方鲀14月齡精巢組織由于過小, 多余的結(jié)締組織和外膜剝離不徹底,故導(dǎo)致14月齡平均每毫克精巢組織獲得的精原干細(xì)胞量顯著低于22月齡, 與理論不符。紅鰭東方鲀精巢沒有哺乳動物睪丸那么硬, 所以本實(shí)驗(yàn)采用比較緩和的胰蛋白酶進(jìn)行消化, 使生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞釋放出來, 并用DNA酶Ⅰ將從剪碎的細(xì)胞游離出來的DNA分解, 防止細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象。結(jié)果證明, 胰蛋白酶和DNA酶Ⅰ組合方法能夠獲得較為滿意的單細(xì)胞懸液。

表 3 各月齡純化前后細(xì)胞存活率、精原干細(xì)胞占比及精原干細(xì)胞量比較Tab. 3 Comparison of cell survival rates/ SSCs proportion/ SSCs counts before and after enrichment

獲得高比例的精原干細(xì)胞的另一個關(guān)鍵因素是對分離的單細(xì)胞懸液進(jìn)行SSCs純化。SSCs純化的方法比較常用的有差異貼壁法、不連續(xù)Percoll密度梯度離心法等[29,30]。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)Percoll密度梯度離心法進(jìn)行SSCs純化。在SSCs純化實(shí)驗(yàn)前, 進(jìn)行了多次的Percoll密度梯度離心實(shí)驗(yàn),優(yōu)化Percoll梯度參數(shù)。起初, 設(shè)置10%、30%、40%、50%和60%共計(jì)5個梯度, 純化后發(fā)現(xiàn): 精原干細(xì)胞主要集中在10%—30%梯度, 30%—40%、40%—50%的2個細(xì)胞帶精原干細(xì)胞量非常少, 而50%—60%看不到細(xì)胞帶, 底部為精細(xì)胞或者血細(xì)胞(圖 5)。所以本實(shí)驗(yàn)將Percoll梯度調(diào)整為10%、30%和50%三個梯度, 經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得了相對較高比例和較高數(shù)量精原干細(xì)胞。分離的14月齡精巢細(xì)胞懸液主要分布在10%—30%, 30%—50%檢測不到生殖細(xì)胞, 50%以下為血細(xì)胞。推測如果將分離前實(shí)驗(yàn)魚放血干凈, 可以不用做Percoll密度梯度純化, 依然可獲得相對較高比例和較高數(shù)量的精原干細(xì)胞。雖然22月齡精巢分離純化獲得的每毫克精巢組織中精原干細(xì)胞量高于14月齡純化前后,但精原干細(xì)胞占比顯著低于14月齡純化前后精原干細(xì)胞占比。綜合分析, 用本文的分離純化方法,14月齡更易獲得所需的精原干細(xì)胞懸液。

圖 5 精原干細(xì)胞純化預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 5 The pre-experimental results of enrichment of SSCs