鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內(nèi)的藥代動力學及殘留消除規(guī)律

余琳雪 劉永濤 丁 浩 蘇志俊 艾曉輝

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223; 2. 上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306;3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室, 北京 100125)

鹽酸氯苯胍(Robenidine hydrochloride, ROBH)是一種人工合成的抗球蟲藥[1], 相對分子量為370.66, 分子式為C15H13Cl2N5·HCl, 屬胍基衍生物[2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 鹽酸氯苯胍是我國允許使用的國標漁藥, 主要用于治療魚類孢子蟲病[3]。近年來, 由于藥物殘留問題帶來的經(jīng)濟損失越來越多, 水產(chǎn)藥物在使用過程中也不可避免會帶來藥物殘留問題, 目前水產(chǎn)品漁藥殘留問題已經(jīng)成為制約我國水產(chǎn)品出口的主要問題。藥物使用不當或使用過量都會引起水產(chǎn)品藥物殘留問題, 水產(chǎn)品中的藥物殘留會危害水產(chǎn)品的質(zhì)量安全, 人們長期食用這些帶漁藥殘留的水產(chǎn)品會嚴重危害身體健康, 同時也會對自然環(huán)境造成污染, 污染水域環(huán)境, 影響水生動物的正常生長。目前, 水產(chǎn)品中藥物殘留的檢測技術(shù)主要有高效液相色譜[4—6]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7,8]和免疫分析法[9,10]。通過對藥物殘留的檢測, 可以制定藥物的最高殘留限量以及休藥期等參數(shù), 確保水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。目前, 關(guān)于鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)體內(nèi)的藥代動力學及殘留消除規(guī)律的研究尚未見報道。

本試驗以斑點叉尾鮰作為研究對象, 研究鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰體內(nèi)的藥代動力學及殘留消除規(guī)律, 制定試驗條件下藥物的休藥期, 保證用藥安全, 旨在為水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題提供理論依據(jù),確保水產(chǎn)動物的食用安全性, 保障人們的生命健康。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

斑點叉尾鮰, 平均體重(200±50) g, 購自中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所基地, 在運至實驗室后, 放置于已清洗并用高錳酸鉀消毒的水族箱(122 cm×80 cm×80 cm)中暫養(yǎng)1周, 試驗用水為充分曝氣的自來水。在暫養(yǎng)結(jié)束后, 選擇無病無傷, 規(guī)格均勻的個體, 控制水溫為(28±1)℃, 自然光照, 連續(xù)24h充氣; 每2天換1次水, 每次換水量1/3; 及時清除水體殘餌和排泄物。

1.2 儀器與試劑

Mettler-TOLE-DOAE-240型精密電子天平(梅特勒-托利多公司)、20PR-520型高速冷凍離心機(日本日立)、調(diào)速混勻器(上?？等A)、氮吹儀(AOSHENG, 杭州奧盛儀器有限公司)、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(Suryeyor MS Pump Plus, Suryeyor Autosampler Plus, Thermo TSQ Quantum Acess MAX)及Thermo LCquan 2.6 數(shù)據(jù)采集處理軟件。

鹽酸氯苯胍(純度≥98%, 質(zhì)量比, 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)、鹽酸氯苯胍-D8標準品(純度≥98%, 質(zhì)量比, 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)、鹽酸氯苯胍原料藥(CAS 25875-50-7, 純度98%, 壽光市華弛化工有限公司)。乙腈、乙酸、乙酸乙酯、正己烷、甲酸(色譜純, 美國J.T. Baker公司)。無水乙醇(分析純, 西隴化工股份有限公司)、蒸餾水, 可溶性淀粉(分析純, 湘中化學試劑供應站)、無水硫酸鎂(分析純, 國藥集團化學試劑有限公司)、肝素鈉(生物級, 上海生化試劑有限公司)。

1.3 給藥及樣品采集

藥代動力學試驗: 鹽酸氯苯按胍20 mg/kg劑量口灌斑點叉尾鮰, 分別于給藥后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h自尾靜脈采血樣, 每個時間點采樣5尾, 從尾靜脈采集血液樣品, 裝于用肝素鈉溶液潤洗的離心管中, 4000 r/min離心5min, 取上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

殘留消除規(guī)律試驗: 按20 mg/kg劑量連續(xù)5d口灌給藥, 分別在最后一次給藥后1d、2d、3d、5d、7d、9d、12d、15d、20d、25d和30d采樣, 采樣方法同藥代組。

1.4 樣品處理

將樣品在室溫下解凍后, 取1 mL血漿或適量組織(肌肉2 g, 其他組織各1 g)于15 mL離心管中, 加入50 μL, 1 μg/mL內(nèi)標溶液氘代鹽酸氯苯胍, 加入7 mL1%甲酸乙酸乙酯溶液, 置調(diào)速混勻器上渦旋振蕩30s, 超聲5min, 再加入0.5 g無水硫酸鎂, 渦旋振蕩30s, 8000 r/min離心5min, 轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中, 再重復上述操作提取一次, 合并2次上清液于離心管中, 置45℃氮吹儀上氮吹至干, 用1 mL定容溶液(0.1%甲酸水溶液∶甲醇=30∶70)溶解殘渣,渦旋振蕩30s, 12000 r/min離心5min, 0.22 μm微孔濾膜過濾后上機檢測。

1.5 儀器條件

色譜柱: Symmetry?C18(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)色譜柱; 流速為250 μL/min; 進樣量20.0 μL;柱溫: 30℃。

質(zhì)譜條件: 采用加熱電噴霧離子源(HESI), 負離子模式; 檢測方式采用選擇反應監(jiān)測(SRM)模式;噴霧電壓: -3000 V; 鞘氣壓力40 kPa; 輔助氣壓力5 kPa; 蒸發(fā)氣溫度: 350℃; 碰撞氣及壓力: 氬氣,1.5 MPa; 離子傳輸毛細管溫度: 350℃。母離子, 定性離子對, 定量離子對和碰撞能量(表 1)。

表 1 鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍質(zhì)譜條件Tab. 1 Mass spectrometry parameters of ROBH and ROBH-D8

1.6 標準曲線的制備及回收率與精密度測定

標準儲備液的制備: 分別準確稱取10 mg的鹽酸氯苯胍標準品和氘代鹽酸氯苯胍標準品, 置于100 mL的容量瓶中, 分別加少量甲醇溶解并定容至100 mL, 配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍標準儲備液, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標準曲線的制備: 以標準儲備液為基礎(chǔ), 配制含氘代鹽酸氯苯胍內(nèi)標50 ng/mL, 鹽酸氯苯胍濃度為0.01、0.05、0.2、0.5、2、5、10和20 μg/mL的標準曲線, 作HPLC-MS分析; 以測得的鹽酸氯苯胍和氘代鹽酸氯苯胍的峰面積比值為縱坐標, 鹽酸氯苯胍的濃度為橫坐標, 計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

回收率與精密度測定: 在空白組織中分別添加3個濃度水平的標準溶液, 使組織中鹽酸氯苯胍質(zhì)量濃度分別為1、10和100 ng/mL, 氘代鹽酸氯苯胍的質(zhì)量濃度為50 ng/mL。每個濃度的樣品5個平行,計算回收率及精密度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

標準曲線, 消除曲線方程采用Microsoft Excel 2013軟件繪制, 藥物動力學模型擬合及參數(shù)計算采用中國藥理學會數(shù)學專業(yè)委員會編制的3p97藥代動力學程序軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線及回收率

在1—20 μg/mL濃度內(nèi)鹽酸氯苯胍線性關(guān)系良好, 線性方程為y=0.0107x+0.0191, 相關(guān)指數(shù)R2=0.9991。

在本試驗建立的色譜條件下, 基線走動平穩(wěn),鹽酸氯苯胍峰形良好, 無明顯雜質(zhì)峰影響。鹽酸氯苯胍的出峰時間為約5.22min, 氘代鹽酸氯苯胍的出峰時間約為5.21min, 樣品的分析時間為9min。并通過內(nèi)標法來對各時間點的組織藥物含量進行測定。

2.2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內(nèi)各組織中的藥時曲線

由圖 1可見, 在各組織中的藥物濃度均出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象, 且2次的達峰時間均為8h和24h, 鹽酸氯苯胍在血漿中的峰濃度值較其他組織高。

表 2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾各組織中的平均加標回收率和精密度Tab. 2 The average recoveries and precisions for ROBH in the Ictalurus punctatus tissues (n=5)

表 2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾各組織中的平均加標回收率和精密度Tab. 2 The average recoveries and precisions for ROBH in the Ictalurus punctatus tissues (n=5)

10 (ng/mL或μg/kg)組織Tissue 1 (ng/mL或μg/kg)100 (ng/mL或μg/kg)血漿Plasma 89.43±2.88 88.07±2.57 95.22±1.51肌肉Muscle 96.50±3.00 107.71±4.26 78.47±2.82皮膚Skin 82.71±3.31 95.89±3.38 98.69±1.92肝Liver 64.02±3.53 81.08±3.05 76.50±1.95腎Kidney 114.17±4.19 91.19±2.66 95.92±3.94鰓Gill 73.92±2.34 81.43±4.52 96.31±4.33腦Brain 81.48±0.05 82.05±1.58 79.72±0.25腸Intestines 77.75±5.35 98.26±2.64 90.27±2.62

圖 1 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的藥時曲線Fig. 1 The concentration-time curve of ROBH in tissues of Ictalurus punctatush (n=5)

2.3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的藥動學參數(shù)

2.4 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內(nèi)的殘留消除規(guī)律

由表 4可見, 鹽酸氯苯胍在腸道中的殘留量最大, 在血漿中的殘留量最低。消除半衰期在各組織中的大小依次為: 腸＞皮膚＞腎臟＞肝臟＞肌肉＞腦＞鰓＞血漿, 說明鹽酸氯苯胍在腸道中消除最慢, 在血漿中消除最快。

2.5 休藥期(WDT)的確定

3 討論

3.1 藥時曲線的雙峰現(xiàn)象

斑點叉尾鮰按20 mg/kg單劑量口灌鹽酸氯苯胍后, 由圖 1可以看出鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的藥-時曲線均出現(xiàn)了明顯的雙峰現(xiàn)象。目前, 關(guān)于口服藥物藥-時曲線的雙峰現(xiàn)象報道較多[11—14],主要有以下幾種解釋: 肝腸循環(huán), 指藥物經(jīng)膽汁排入十二指腸后, 部分藥物可再經(jīng)小腸上皮細胞被重新吸收返回肝臟, 從而引起雙峰現(xiàn)象的出現(xiàn); 雙部位吸收, 指口服藥物在胃腸兩個不同部位吸收時, 有快有慢, 因而出現(xiàn)雙峰; 胃排空, 由于胃在一定的時間會進行排空, 因而導致藥物進入小腸的時間不同, 造成藥物2次入血, 出現(xiàn)雙峰。而脂溶性藥物在口服吸收后, 迅速分布到組織中, 在血液中藥物代謝到一定程度后, 也會出現(xiàn)二次釋放入血, 出現(xiàn)雙峰。此外, 雙峰現(xiàn)象還可能與藥物的分布、重吸收有關(guān), 即當其他組織的藥物濃度高于血漿藥物濃度時, 藥物可能會轉(zhuǎn)移到血中, 引起血藥濃度的再次升高[15]。

表 3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的主要藥代動力學參數(shù)Tab. 3 The pharmacokinetic parameters of ROBH in tissues of Ictalurus punctatush

表 3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾組織中的主要藥代動力學參數(shù)Tab. 3 The pharmacokinetic parameters of ROBH in tissues of Ictalurus punctatush

注: A為分布相的零時截距; α為分布速率常數(shù); B為消除相的零時截距; β為消除速率常數(shù); Ka為吸收速率常數(shù); T1/2為消除半衰期;Tpeak為達峰時間; Cmax為峰濃度; AUC為藥時曲線下面積; CL為總清除率; V/F為相對表觀容積Note: A. Zero intercept of distribution phase; α. Distribution rate constant; B. Zero intercept of phase elimination; β. Elimination rate constant; Ka. Absorption rate constant; T1/2. Elimination half-life; Tpeak. The time at highest peak of concentration; Cmax. The biggest concentration of the drug in plasma; AUC. Area under concentration-time curve; CL. The overall clearance rate; V/F. Apparent volume of distribution

參數(shù)Parameters 單位Unit 血漿Plasma 肌肉Muscle 皮Skin 鰓Gill 肝臟Liver 腎臟Kidney Aμg/mL 7.69 - - - - -Bμg/mL 0.13 - - - - -α 1/h 0.02 - - - - -β 1/h 0.01 - - - - -ka 1/h 0.27 - - - - -T1/2 h 58.63 23.57 35.37 19.74 29.34 43.30 T(peak) h 10.03 15.79 11.10 2.61 12.89 7.87 Cmax mg/kg或μg/mL 5.76 2.91 2.90 3.05 3.04 0.42 AUC (mg/kg)/h或(μg/mL)/h 326.74 157.58 183.72 95.09 174.82 29.85 CL L/(h·kg) 0.06 0.13 0.11 0.21 0.11 0.67 V/F(c) L/kg 2.78 4.32 5.55 5.99 4.84 41.85

表 4 斑點叉尾口灌鹽酸氯苯胍后組織中的消除曲線方程及參數(shù)Tab. 4 The equation of elimination curve and parameters in tissues of Ictalurus punctatus after oral administration of ROBH

表 4 斑點叉尾口灌鹽酸氯苯胍后組織中的消除曲線方程及參數(shù)Tab. 4 The equation of elimination curve and parameters in tissues of Ictalurus punctatus after oral administration of ROBH

組織Tissue消除方程Equation相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R2)消除半衰期(T1/2)Elimination half-life (d)血漿Plasma C血=612.53e-0.416t 0.9387 1.66肌肉Muscle C肌肉=504.46e-0.268t 0.9233 2.58 Liver C肝=1127.6e-0.19t 0.9552 3.65肝 腎Kidney C腎=1086.1e-0.168t 0.9664 4.12皮Skin C皮=2099.6e-0.235t 0.9628 2.95鰓Gill C鰓=4149.2e-0.31t 0.9585 2.24腸Intestines C腸=15060e-0.13t 0.9562 5.33腦Brain C腦=3257.1e-0.273t 0.9537 2.54

3.2 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內(nèi)藥動學特征

將鹽酸氯苯胍以20 mg/kg劑量單次口灌斑點叉尾鮰后, 通過3p97軟件分析, 可知鹽酸氯苯胍主要分布于斑點叉尾鮰的皮、肌肉和肝臟組織中, 藥物在腎臟中駐留時間最長。湯菊芬等[16]在紅笛鯛口灌鹽酸氯苯胍后, 發(fā)現(xiàn)藥物主要分布于腎臟和肝臟,在肌肉中平均駐留時間最長, 消除半衰期明顯高于腎臟和肝臟; 在眼斑擬石首魚[17]中, 鹽酸氯苯胍主要分布在腎臟中, 藥物在肝臟中的平均駐留時間最長, 其消除半衰期也高于腎臟和肌肉。可見藥物在體內(nèi)的分布情況和代謝速率與作用對象密切相關(guān)。

3.3 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內(nèi)的殘留消除規(guī)律

將鹽酸氯苯胍以20 mg/kg的劑量連續(xù)口灌斑點叉尾鮰5d后, 第1天藥物在腸道內(nèi)的殘留量遠高于其他組織, 濃度高達16.44 mg/kg, 而在其他組織中的藥物殘留濃度依次為: C鰓＞C腦＞C皮膚＞C肝＞C腎＞C血漿＞C肌肉, 說明鹽酸氯苯胍進入體內(nèi)后, 優(yōu)先分布在腸、鰓、腦、皮膚等組織。而魚類孢子蟲病主要就是寄生在這些部位中, 這就促進了藥物療效的發(fā)揮, 但由于消除速率相對較快, 不會在腦中長時間殘留, 既能充分發(fā)揮藥物作用, 又可降低對腦神經(jīng)的損傷。其在肌肉中的殘留量最低且消除速率較快, 在腸道中的消除最慢。班付國等[18]研究了雞組織中的氯苯胍的殘留消除規(guī)律, 結(jié)果顯示, 氯苯胍在肌肉中的殘留量最低且消除速度最快。李強[19]在對兔體內(nèi)氯苯胍殘留消除規(guī)律進行了研究, 結(jié)果表明, 氯苯胍在兔的肝臟中藥物殘留量最高, 在肌肉和腎臟中殘留極少, 消除迅速, 在停喂3d后就檢測不到了。這與本文的研究結(jié)果基本一致, 但鹽酸氯苯胍在鮰體內(nèi)的消除速率比在雞、兔體內(nèi)較為緩慢, 這可能是因為不同研究對象對藥物的代謝速率不同。

3.4 鹽酸氯苯胍在斑點叉尾體內(nèi)的休藥期

目前, 關(guān)于鹽酸氯苯胍在可食動物產(chǎn)品中的最高殘留限量在國內(nèi)外都有相關(guān)的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布第235號公告, 規(guī)定氯苯胍在雞脂肪、皮、可食組織中的最高殘留限量分別為200、200和100 μg/kg[20]。2012年, 美國《聯(lián)邦規(guī)章典集》中的關(guān)于鹽酸氯苯胍在雞脂肪、皮及其他可食用組織中的最高殘留限量規(guī)定與我國相同[21]。加拿大規(guī)定鹽酸氯苯胍在雞、兔子、火雞肌肉中的最大殘留限量均為100 μg/kg[22]。而關(guān)于水產(chǎn)品中鹽酸氯苯胍的最大殘留限量尚無明確規(guī)定[23]。根據(jù)日本2006年實施的食品中農(nóng)業(yè)化學品殘留“肯定列表制度”, 要求對于未制定最大殘留限量標準的農(nóng)業(yè)化學品在食品中含量不得超過10 μg/kg[24]。本研究將10 μg/kg作為鹽酸氯苯胍的最高殘留限量, 在肌肉組織中在第12天后含量為8 μg/kg, 低于最高殘留限量, 而本試驗對魚皮中藥物殘留量也進行了測定, 在第20天后魚皮的濃度為9 μg/kg, 低于最高殘留限量。而通過休藥期公式計算可知, 理論上鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰肌肉中的休藥期為15d, 皮膚中的休藥期為23d, 肝臟中的休藥期為25d,腎臟中的休藥期為28d。考慮到在實際中內(nèi)臟往往都會被去除, 故以可食性組織肌肉和皮膚為標準來制定休藥期, 在本試驗條件下, 建議鹽酸氯苯胍在斑點叉尾鮰體內(nèi)的休藥期至少應為23d。