俄羅斯鱘補(bǔ)體C7基因的克隆及表達(dá)分析

孫夢(mèng)潔 陳亞?wèn)| 高 杰 江炎亮 張 雪 佘定懿 許式見(jiàn) 胡 謀趙愛(ài)云 沙珍霞,

(1. 青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島266235; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動(dòng)物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100141; 5. 杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司, 杭州 311700)

補(bǔ)體系統(tǒng)是迄今所知生物體內(nèi)最復(fù)雜的一個(gè)限制性蛋白水解系統(tǒng), 在先天性免疫中起重要作用,在獲得性免疫被激活之前能抵抗細(xì)菌和病毒的入侵[1]。魚(yú)類補(bǔ)體通過(guò)經(jīng)典途徑、替代途徑、凝集素途徑激活, 形成環(huán)狀成孔的膜攻擊復(fù)合物(Membrane attack complex, MAC)[2], 其抵抗細(xì)菌的免疫保護(hù)取決于MAC的殺菌活性。MAC由C5b、C6、C7、C8和C9聚集形成, 首先, C5可以分解為小片段的C5a和C5b, C5a是一種重要的炎癥介質(zhì), 不溶于液相, 而C5b和C6在激活細(xì)胞附近通過(guò)亞穩(wěn)結(jié)合位點(diǎn), 形成穩(wěn)定的C5b-6二聚體[3]。然后, C5b-6自發(fā)地與C7結(jié)合形成C5b-7三聚體, 從而使中間產(chǎn)物暴露出膜結(jié)合位點(diǎn), 并產(chǎn)生一個(gè)短暫的高親和性脂結(jié)合位點(diǎn), 該結(jié)合位點(diǎn)可以非特異性地與周圍的靶細(xì)胞結(jié)合并插入到其細(xì)胞膜中。結(jié)合到膜上的C5b-7可以與C8結(jié)合, 最終與C9結(jié)合形成跨膜復(fù)合體。其中, C7是形成MAC的關(guān)鍵, 在細(xì)胞裂解、宿主防御、促進(jìn)炎癥中起主要作用。

俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedti), 隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes), 輻鰭亞綱(Actinopterygii), 軟骨硬鱗總目(Chondrostei), 鱘形目(Acipenseriformes), 是生存至今的古老種群之一, 也是個(gè)體最大、壽命最長(zhǎng)的淡水魚(yú)[4]。其魚(yú)子醬具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 俗稱“黑黃金”。然而, 在養(yǎng)殖過(guò)程中頻繁發(fā)生的病害問(wèn)題對(duì)俄羅斯鱘養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失[5]。其中, 俄羅斯鱘病害尤以敗血癥為甚, 危害較大的細(xì)菌性病原主要是嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等。

隨著漁業(yè)生產(chǎn)越來(lái)越強(qiáng)調(diào)綠色、生態(tài)、可持續(xù)的發(fā)展道路, 免疫增強(qiáng)劑等在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。其中殼寡糖具有分子量小、生物相容性好、生物降解性好等優(yōu)點(diǎn), 并且具有廣譜抗菌活性, 可以提高機(jī)體免疫力, 對(duì)腸道菌群分布也有重要影響[6,7], 特別適合作為水產(chǎn)動(dòng)物的飼料添加劑, 以預(yù)防和控制疾病。在基礎(chǔ)飼料中添加適量的殼寡糖可以顯著提高吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)(Oreochromis niloticus)[8]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[9]、虹鱒幼魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)[10]、錦鯉(Cyprinus carpio koi)[11]等免疫調(diào)節(jié)能力。鑒于俄羅斯鱘補(bǔ)體C7基因的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道, 本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)俄羅斯鱘補(bǔ)體C7基因(AgC7)進(jìn)行克隆鑒定, 分析其在健康組織、殼寡糖刺激后的組織及細(xì)菌感染的免疫組織中的表達(dá)變化, 揭示AgC7基因與俄羅斯鱘免疫的相關(guān)性, 為俄羅斯鱘健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)、殼寡糖飼料和病原菌

健康俄羅斯鱘[體重(450.0±10.0) g, 體長(zhǎng)(47.5±2.5) cm, 魚(yú)齡12個(gè)月左右]由浙江杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開(kāi)發(fā)有限公司提供; 殼寡糖為衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開(kāi)發(fā)有限公司惠贈(zèng)(購(gòu)自青島市諾瑪科生物技術(shù)有限公司); 基礎(chǔ)飼料由天邦食品股份有限公司寧波分公司提供; 實(shí)驗(yàn)所用的嗜水氣單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室從俄羅斯鱘病魚(yú)個(gè)體中分離獲得, 并根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列進(jìn)行了鑒定。

1.2 飼喂實(shí)驗(yàn)

俄羅斯鱘在戶外帶有遮陽(yáng)棚的水泥養(yǎng)殖池(直徑4.0 m, 深度1.8 m, 水深0.8 m)中進(jìn)行流水養(yǎng)殖, 養(yǎng)殖用水引自烏溪江, 水溫保持(22±3)℃。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用基礎(chǔ)飼料飼喂俄羅斯鱘10d, 以消除環(huán)境脅迫,殼寡糖飼料飼喂組(以下均簡(jiǎn)稱為實(shí)驗(yàn)組)和普通飼料飼喂組(以下均簡(jiǎn)稱為對(duì)照組)各設(shè)3個(gè)平行組, 每組100條魚(yú), 按照3.00%質(zhì)量比添加殼寡糖制備含糖飼料, 用于實(shí)驗(yàn)組俄羅斯鱘的飼喂; 對(duì)照組采用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行飼喂[12], 每組飼喂時(shí)間均為60d, 每天按照俄羅斯鱘體重的5.00%投喂飼料2次, 同時(shí)進(jìn)行常規(guī)的殘餌和糞便清理以保證水體清潔。

1.3 感染實(shí)驗(yàn)

在嗜水氣單胞菌感染實(shí)驗(yàn)中, 實(shí)驗(yàn)組用半致死劑量的菌液(半致死劑量3.18×105CFU/g)對(duì)健康俄羅斯鱘進(jìn)行腹腔注射, 對(duì)照組用同體積的PBS (300 μL/200 g)腹腔注射健康俄羅斯鱘, 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取72個(gè)鱘魚(yú)個(gè)體[13]。

1.4 樣品的采集與保存

在組織取樣前, 將所有組的俄羅斯鱘饑餓處理24h, 然后解剖分離組織。分別隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的各3尾俄羅斯鱘分離血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、肌肉、皮膚、脾、胃和后腎組織; 在嗜水氣單胞菌感染實(shí)驗(yàn)中, 腹腔注射0、6h、12h、24h、48h、72h和96h后分別隨機(jī)選取3尾俄羅斯鱘分離血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾組織。將所有收集的組織立即放入液氮中, 然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中長(zhǎng)期保存, 以備RNA提取。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根, 北京)的說(shuō)明書(shū), 從保存于-80℃的各種組織中提取總RNA。然后用Agilent 2100 biological analyzer (Applied Biosystems, 美國(guó))檢測(cè)其質(zhì)量和濃度, 瓊脂糖凝膠電泳(1.00%)檢測(cè)提取的RNA的完整性。最后,用DNaseⅠ酶于37℃下消化30min以去除殘留的DNA[14]。用Prime ScriptTMRT reagent Kit (寶生物,大連)合成cDNA第一條鏈, 合成的cDNA放置在-20℃冰箱。

1.6 AgC7基因cDNA全長(zhǎng)克隆

根據(jù)從俄羅斯鱘性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的AgC7基因部分序列[15], 用Primer 5設(shè)計(jì)特異性引物(表 1), 通過(guò)普通PCR和RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)克隆擴(kuò)增AgC7基因的全長(zhǎng)cDNA序列。首先, 通過(guò)普通PCR反應(yīng)獲得AgC7基因的部分序列, 反應(yīng)體系: 1.0 μL cDNA模板(100 ng/μL)、1.0 μL上游引物(10 μmol/L)、1.0 μL下游引物(10 μmol/L)、4.0 μL dNTP Mix、5.0 μL 10×RTaqBuffer、0.5 μL RTaq和37.5 μL ddH2O; 擴(kuò)增程序設(shè)定為: 95℃7min預(yù)變性; 95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 3min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析、切膠回收純化后, 連接到Trans-T1載體(全式金, 北京)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序, 驗(yàn)證AgC7基因的部分序列[16]。然后采用Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)進(jìn)行3′RACE和5′RACE擴(kuò)增以獲得AgC7基因的完整cDNA序列。反應(yīng)體系: 1.0 μL cDNA模板(100 ng/μL)、1.0 μL上游引物(10 μmol/L)、1.0 μL下游引物(10 μmol/L)、3.5 μL PCR MasterMix (含染料)和13.5 μL ddH2O;擴(kuò)增程序設(shè)定為: 95℃ 5min預(yù)變性; 94℃ 30s, 55℃30s, 72℃ 60s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸7min。

表 1 俄羅斯鱘補(bǔ)體C7基因克隆和表達(dá)分析所用引物Tab. 1 PCR primers used for cloning of C7

1.7 AgC7基因的序列分析

將測(cè)序得到的AgC7基因的cDNA序列信息提交到NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi), 通過(guò)BLAST程序?qū)ζ溥M(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)。通過(guò)NCBI ORF Finder (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), 分析cDNA序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)。使用ExPasy website (http://www.expasy.org)預(yù)測(cè)氨基酸序列, 用Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。通過(guò)DNAMAN對(duì)AgC7與GenBank上下載的其他物種的C7進(jìn)行多重序列比對(duì), 利用MEGA 5.1軟件中相鄰連接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用SignalP 4.0 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè), 在SMART online tool (http://smart.emblheidelberg.de)中預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.8 AgC7基因的表達(dá)分析

使用ABI PRISM 7500HT熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 美國(guó)), 采用SYBR?Premix ExTaq?(寶生物, 大連)進(jìn)行AgC7的qRT-PCR檢測(cè), 研究AgC7基因在俄羅斯鱘健康組織、殼寡糖刺激后的組織及病原刺激后的免疫組織中的表達(dá)水平。用FastKing RT Kit試劑盒(With gDNase) (寶生物, 大連)合成cDNA第一條鏈, 稀釋10倍作為qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板, 以俄羅斯鱘18S rRNA為內(nèi)參, 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù), 反應(yīng)體系如下: 0.6 μL上游引物(10 μmol/L)、0.6 μL下游引物(10 μmol/L)、10.0 μL 2×Realtime PCR Super mix、1.0 μL cDNA sample(100 ng/μL)和7.8 μL ddH2O[17]。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性8min; 95℃變性10s, 60℃退火20s, 72℃延伸35s, 40個(gè)循環(huán); 72℃延伸7min。實(shí)驗(yàn)中使用的引物如表 1。

1.9 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)7500 software v2.0.6.處理后, 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean± SD)表示, 使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 采用單因子方差分析(One-Way ANOVA), Duncan多重比較組間的差異性, 以P＜0.05為顯著性差異。最后, 用Origin 9軟件對(duì)相對(duì)定量表達(dá)做直方圖。

2 結(jié)果

2.1 AgC7基因的cDNA全長(zhǎng)克隆

將克隆獲得的AgC7基因cDNA的5′-UTR和3′-UTR進(jìn)行序列拼接并通過(guò)BLAST分析后確定為補(bǔ)體C7。AgC7基因的cDNA全長(zhǎng)為3103 bp (GenBank登錄號(hào): MH973660), 5′-UTR為44 bp, 3′-UTR為554 bp,開(kāi)放閱讀框(Open Read Frame, ORF)為2502 bp, 編碼833個(gè)氨基酸殘基, 加尾信號(hào)在PolyA上游20位核苷酸處。

2.2 AgC7基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

推導(dǎo)的AgC7蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為92.3 kD,等電點(diǎn)為6.24, GC含量為45.64%。AgC7蛋白存在16個(gè)氨基酸殘基(Amino acid, aa)的信號(hào)肽序列(3—18 aa), 其中包括8個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域、2個(gè)TSP1結(jié)構(gòu)域(32—82和492—540 aa)、1個(gè)LDLa結(jié)構(gòu)域(86—123 aa)、2個(gè)FIMAC結(jié)構(gòu)域(687—755和760—832 aa)、1個(gè)MACPF結(jié)構(gòu)域(237—439 aa)和2個(gè)CCP結(jié)構(gòu)域(560—615和620—677 aa, 圖 1)。

AgC7蛋白與其他魚(yú)類的補(bǔ)體C7有廣泛的同源性, 其中與斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteus oculatus, XP0066 26977.1)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus, XP01732 2364.1)、斑馬魚(yú)(Danio rerio, XP005161294.1)、大西洋鮭(Salmo salar, NP001133245.1)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus, XP005470513.1)等魚(yú)的氨基酸序列一致性分別為56%、46%、49%、49%和47%。將俄羅斯鱘補(bǔ)體C7與這5種魚(yú)類補(bǔ)體C7的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 可以看出, 魚(yú)類補(bǔ)體C7存在一些高度保守的氨基酸殘基, 尤其是Cys殘基, 其分子間形成的二硫鍵在蛋白折疊和功能驅(qū)使中起重要作用[18]。

圖 1 補(bǔ)體C7的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域Fig. 1 Domain structure prediction of complement C7

從NCBI blast的比對(duì)結(jié)果中選取來(lái)源于其他物種補(bǔ)體C7的氨基酸序列, 包括哺乳類人(Homo sapiens, J03507.1)、蘇門(mén)答臘猩猩(Pongo abelii, NM 001132284.1)、家鼠(Mus musculus, NM0012438 37.1); 兩棲類非洲爪蟾(Xenopus laevis, NM00109 1647.1); 爬行類揚(yáng)子鱷(Alligator sinensis, XP006 033524.1); 魚(yú)類斑點(diǎn)雀鱔(L. oculatus, XP006626 977.1)、(Miiuy croaker, KP689602.1)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix, JN806258.1)、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus, AB020964.1)、虹鱒(O. mykiss,NM001124618.1)、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella,JN655169.1)、斑馬魚(yú)(D. rerio, XP005161294.1)、尼羅羅非魚(yú)(O. niloticus, XP005470513.1), 用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖 2)。從圖 2可以看出, 魚(yú)類C7聚在一起, 其中AgC7與鰱處于同一分支上, 親緣關(guān)系較近, 然后與褐牙鲆、虹鱒、草魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)聚為一類, 而斑點(diǎn)雀鱔和鮸魚(yú)聚為另一類, 水生動(dòng)物的補(bǔ)體C7與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖 2 俄羅斯鱘補(bǔ)體C7的進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Russian sturgeon complement C7

2.3 AgC7基因在健康俄羅斯鱘組織中的表達(dá)分析

AgC7基因在檢測(cè)的健康俄羅斯鱘血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、肌肉、皮膚、脾、胃和后腎共13種組織中均表達(dá)。設(shè)定表達(dá)量最低的肌肉為參考值1.00, 相對(duì)表達(dá)量最高的組織是腸(211), 其次是腦(90)、血液(72)、頭腎(52)和心臟(41), 在胃(33)、肝(18)、脾(17.1)、鰓(12.5)、性腺(8.1)、皮膚(5.6)及后腎(1.2)中的表達(dá)量相對(duì)較低,AgC7基因在不同組織中表達(dá)存在組織特異性(圖 3)。用添加殼寡糖的飼料飼喂健康俄羅斯鱘60d,AgC7基因的相對(duì)表達(dá)量如圖 3, 結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組基因的相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組, 殼寡糖能夠誘導(dǎo)AgC7基因的上調(diào)表達(dá)。且AgC7基因在腸中表達(dá)上升的趨勢(shì)最明顯, 約為對(duì)照組的1.51倍。腸道是主要的免疫器官, 補(bǔ)體表達(dá)量提高, 可以抵抗微生物感染。

2.4 細(xì)菌性病原刺激后AgC7基因在俄羅斯鱘免疫組織中的表達(dá)分析

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染健康俄羅斯鱘后,AgC7基因在免疫組織中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平如圖 4,結(jié)果顯示:AgC7基因的表達(dá)量迅速上升, 隨著病原菌感染時(shí)間增加, 基因表達(dá)量逐漸下降并恢復(fù)至正常水平。設(shè)組織中0的基因表達(dá)量為參考值1.00。血液中AgC7基因表達(dá)上調(diào), 最大表達(dá)量出現(xiàn)在感染后72h, 是對(duì)照組的4.23倍; 在鰓中AgC7基因表達(dá)的上調(diào)趨勢(shì)最明顯, 最大表達(dá)量出現(xiàn)在感染后6h,為對(duì)照組的41.30倍, 12h后基因表達(dá)迅速下降并恢復(fù)至正常水平; 在頭腎和脾中基因的表達(dá)呈現(xiàn)相同的上調(diào)趨勢(shì), 其表達(dá)峰值出現(xiàn)在嗜水氣單胞菌感染后24h, 在頭腎中為對(duì)照組表達(dá)量的2.70倍, 在脾中為對(duì)照組表達(dá)量的6.01倍; 在腸和肝中AgC7基因表達(dá)量變化不大, 在腸中最大表達(dá)量出現(xiàn)在感染后6h,是對(duì)照組的1.58倍, 在肝中最大表達(dá)量出現(xiàn)在感染后12h, 是對(duì)照組的1.48倍。

圖 3 補(bǔ)體C7基因在俄羅斯鱘健康組織及殼寡糖刺激后的組織中的實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析Fig. 3 The gene expressions of AgC7 in all tissues from healthy Russian sturgeon and chitosan oligosaccharide stimulated group血液(Bl)、腦(Br)、鰓(Gi)、性腺(Go)、心臟(He)、頭腎(Hk)、腸(In)、肝臟(Li)、肌肉(Mu)、皮膚(Sk)、脾(Sp)、胃(St)、后腎(Tk)。用SPSS 19.0軟件, 采用單因子方差分析法(One-Way ANOVA)分析數(shù)據(jù)差異性, 圖中“a, b, c”為SPSS軟件中Duncan算法計(jì)算出的子集分組。有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05), 無(wú)相同字母表示差異顯著(P＜0.05)Blood (Bl), brain (Br), gills (Gi), gonad (Go), heart (He), head kidney (Hk), intestine (In), Liver (Li), muscle (Mu), skin (Sk),spleen (Sp), stomach (St), trunk kidney (Tk). Statistical analysis of differences was done by one-way analysis of variance (ANOVA)on SPSS 19.0 software, the letters “a, b, c” are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicated that there was no significant difference in groups (P＞0.05), the different letters indicated that there was significant difference in groups (P＜0.05)

3 討論

研究表明, 補(bǔ)體C7與C5b、C6、C8、C9形成膜攻擊復(fù)合物, 它們都屬于同一個(gè)基因家族, 可能由同一個(gè)原始基因經(jīng)過(guò)一系列進(jìn)化形成[19]。免疫系統(tǒng)作為機(jī)體生存的必需部分, 可以保護(hù)機(jī)體免受病原體的侵害。目前, 先天性免疫和獲得性免疫已得到全面研究, 獲得性免疫可以追溯到脊椎動(dòng)物進(jìn)化的早期階段[2]; 相比較而言, 先天性免疫是一種古老的防御機(jī)制, 并在獲得性免疫激活之前發(fā)揮作用,所以補(bǔ)體系統(tǒng)的重要性是不言而喻的。在哺乳動(dòng)物之外的物種中很少有關(guān)于補(bǔ)體C7的研究, 魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)的研究始于20世紀(jì)80年代, 但有關(guān)魚(yú)類補(bǔ)體C7的報(bào)道還比較少。補(bǔ)體C7基因最早在人類血清中被發(fā)現(xiàn); 在硬骨魚(yú)類中,C7基因最早在日本比目魚(yú)中得到克隆鑒定[19]。此后, 對(duì)虹鱒(O. mykiss)[19]、草魚(yú)(C. idellus)[18]、鰱(H. molitrix)[20]和(M. mii-uy)[21]等物種進(jìn)行了C7基因的克隆和分析, 其他魚(yú)類的研究仍然相對(duì)較少。2005年Zarkadis等[22]從虹鱒中分離得到C7-1(編碼808個(gè)氨基酸)和C7-2(編碼845個(gè)氨基酸)2個(gè)基因亞型, 并顯示虹鱒C7發(fā)生了基因復(fù)制。在硬骨魚(yú)類和哺乳動(dòng)物之間, 補(bǔ)體成分有一些相似的結(jié)構(gòu)單元, 如TSP1、LDLa、MACPF。虹鱒C7-1基因結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)TSP1和2個(gè)CCP, 及LDLRa、MACPF、EGF、FIMAC各1個(gè),虹鱒C7-2除了含有虹鱒C7-1所含有的結(jié)構(gòu)單元外,還多含有一個(gè)FIMAC, 而這第2個(gè)FIMAC可能與增強(qiáng)C7-2與C5b-6二聚體復(fù)合物之間的相互作用有關(guān)[22]。C7-1和C7-2則具有相似的結(jié)構(gòu)域, 但進(jìn)化模式不同, 在健康組織和感染組織中表達(dá)模式不同, 但在抵抗病原感染中均發(fā)揮重要作用[21]。本研究對(duì)俄羅斯鱘補(bǔ)體C7進(jìn)行了分子克隆和鑒定, 獲得了其全長(zhǎng)cDNA序列, 并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 發(fā)現(xiàn)其同樣含有這些保守結(jié)構(gòu), 說(shuō)明俄羅斯鱘補(bǔ)體C7具有抵抗外源病原體保護(hù)機(jī)體的免疫功能。

研究基因的組織分布模式有助于初步了解這些基因的生理功能。補(bǔ)體基因作為一種免疫分子,普遍存在于生物體各個(gè)組織, 并參與生物體抵抗病原微生物的入侵過(guò)程。熒光定量PCR分析表明,AgC7基因在健康俄羅斯鱘13種組織中均表達(dá)良好,但不同組織間的表達(dá)水平差異很大, 且在腸中表達(dá)水平最高, 一方面表明補(bǔ)體C7在各個(gè)組織中起著廣泛的作用, 執(zhí)行相同的免疫防御功能; 另一方面不同組織差異性的表達(dá)模式可能反應(yīng)了不同組織特有的生物學(xué)作用, 這與其他水生動(dòng)物的表達(dá)特征有些不同。研究發(fā)現(xiàn), 草魚(yú)補(bǔ)體C7在心臟、頭腎、腸、肝、皮膚、脾、后腎中表達(dá), 且在肝臟中表達(dá)水平最高, 在血液、腦、鰓、肌肉中不表達(dá)[18];補(bǔ)體C7-1和C7-2在腦、眼、鰭、鰓、心臟、頭腎、腸、肝、肌肉、脾中均表達(dá), 且均在肝臟中表達(dá)水平最高, 在其他組織中表達(dá)量不同[21]; 虹鱒補(bǔ)體C7在腎、脾中不表達(dá), 在其他組織中均表達(dá)[19]。用含殼寡糖的飼料飼喂健康的俄羅斯鱘60d, 組織中補(bǔ)體C7基因的表達(dá)水平均上調(diào)。殼寡糖對(duì)免疫器官及多種免疫細(xì)胞有重要的免疫調(diào)節(jié)作用, 激活補(bǔ)體系統(tǒng)并能誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子, 完善了機(jī)體免疫系統(tǒng), 促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng), 進(jìn)而發(fā)揮免疫增強(qiáng)的作用[6,23]。由于近幾年養(yǎng)殖環(huán)境的變化及國(guó)家對(duì)養(yǎng)殖安全的高度重視, 因此尋求綠色環(huán)保的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治方法迫在眉睫。目前, 殼寡糖在禽畜方面的應(yīng)用存在很多的報(bào)道, 例如肉雞(Broilers)[24]、鼠(Mice)[25]、豬(Growing pigs)[26], 大多數(shù)研究證明殼寡糖可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力, 是一種無(wú)污染、無(wú)殘留的飼料添加劑。在水產(chǎn)動(dòng)物方面研究發(fā)現(xiàn), 在殼寡糖的刺激作用下, 三疣梭子蟹血淋巴中的過(guò)氧化物酶活性會(huì)增強(qiáng); 在基礎(chǔ)飼料中添加適量的殼寡糖也可以顯著提高魚(yú)類等免疫調(diào)節(jié)能力。本研究探討了殼寡糖能夠誘導(dǎo)俄羅斯鱘補(bǔ)體C7基因的表達(dá), 進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫。

補(bǔ)體C7, 作為膜攻擊復(fù)合物的重要組成成分,在抵御外源細(xì)菌或真菌的入侵中起重要作用。目前對(duì)魚(yú)類補(bǔ)體C7生物學(xué)活性的研究主要集中在抗菌和抗病毒等免疫活性方面。草魚(yú)在嗜水氣單胞菌(革蘭氏陰性菌)感染后, 頭腎中的補(bǔ)體C7上調(diào)表達(dá)量最明顯, 在第7天達(dá)到峰值, 肝、脾、后腎組織補(bǔ)體C7基因表達(dá)量也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)[18]。鰱補(bǔ)體C7基因在健康個(gè)體中只在脾中表達(dá), 而感染嗜水氣單胞菌12h后,C7基因在腦、鰓、心、腎、腸、肝、脾7種組織中迅速表達(dá), 隨著病原菌感染時(shí)間增加, 補(bǔ)體C7基因的表達(dá)量逐漸降低直至恢復(fù)正常水平[20]。在俄羅斯鱘感染嗜水氣單胞菌后, 血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾6種組織中AgC7基因的表達(dá)均上調(diào), 說(shuō)明俄羅斯鱘AgC7對(duì)嗜水氣單胞菌的入侵具有快速響應(yīng)作用, 機(jī)體大量表達(dá)AgC7以抵御細(xì)菌感染。隨著感染時(shí)間的推移, 俄羅斯鱘AgC7基因的表達(dá)量也逐漸下降, 恢復(fù)至正常水平,這與Ewart等[18]的研究報(bào)道一致。由此推測(cè), 俄羅斯鱘AgC7在抵抗細(xì)菌感染中具有重要作用。

圖 4 嗜水氣單胞菌感染健康俄羅斯鱘后補(bǔ)體C7基因在免疫組織中的實(shí)時(shí)定量分析Fig. 4 The expression level of AgC7 in immune tissues after challenging the Russian sturgeon with Aeromonas hydrophila血液(Bl)、鰓(Gi)、頭腎(Hk)、腸(In)、肝臟(Li)、脾(Sp); 用SPSS 19.0軟件, 采用單因子方差分析法(One-Way ANOVA)分析數(shù)據(jù)差異性, 圖中“a, b, c”為SPSS軟件中Duncan算法計(jì)算出的子集分組; 有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05), 無(wú)相同字母表示差異顯著(P＜0.05)Blood (Bl), gills (Gi), head kidney (Hk), intestine (In), liver (Li), spleen (Sp). Statistical analysis of differences was done by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS v19.0 software, the letters “a, b, c” are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicated that there was no significant difference in groups (P＞0.05), the different letters indicated that there was significant difference in groups(P＜0.05)

俄羅斯鱘AgC7具有典型的補(bǔ)體C7基因特征,且殼寡糖刺激和病原感染后均可引起AgC7基因表達(dá)變化, 補(bǔ)體C7可能參與了俄羅斯鱘的免疫應(yīng)答。